CHE COS'È PSEUDOVIRUS NEUTRALIZATION ASSAY?
Un Pseudovirus Neutralization Assay (noto anche come test di neutralizzazione dei virus pseudotipizzati o test di neutralizzazione basato su pseudotipi) è un metodo di laboratorio utilizzato per studiare l'effetto di anticorpi o farmaci per neutralizzare la capacità dei virus di entrare nelle cellule e quindi prevenire l'infezione.
Gli pseudotipi o particelle pseudotipizzate sono "virus" chimerici costituiti da un nucleo virale (tipicamente un vettore lentivirale) circondato da un involucro lipidico con le glicoproteine di superficie di un altro virus (il virus di interesse). Utilizzando un vettore che non può replicarsi e quindi non è patogeno, i virus possono essere studiati in un sistema più sicuro. Nel caso di SARS-CoV-2, lo pseudovirus deve esprimere la glicoproteina S, che media l'ingresso nelle cellule ospiti legandosi all'enzima di conversione dell'angiotensina 2 umana (ACE2). Oltre alle glicoproteine di superficie del virus di interesse, il virus pseudotipato contiene il gene di una luciferasi, che viene espresso solo dopo essere entrato nella cellula. Più pseudovirus entrano nelle cellule, più luciferasi viene espressa e maggiore è l'intensità della luce emessa.
Il test di neutralizzazione dello pseudovirus prevede l'incubazione delle cellule e dello pseudovirus in presenza di diverse concentrazioni di un anticorpo di interesse e la misura dell'emissione di luce utilizzando un luminometro a piastra o un lettore multimodale. Se l'anticorpo è efficace nel neutralizzare le glicoproteine di superficie e nel bloccare l'ingresso nelle cellule, verrà misurata una significativa riduzione dell'emissione di luce. L'effetto dell'anticorpo viene visualizzato utilizzando una delle concentrazioni inibitorie (IC50, IC80 o altre).
PERCHÉ I SAGGI DI NEUTRALIZZAZIONE DI PSEUDOVIRUS SONO IMPORTANTI?
I saggi di neutralizzazione sono strumenti molto preziosi per studiare le risposte anticorpali (umani e animali) contro i virus, provocati dalla vaccinazione, da altre terapie o dall'esposizione naturale. Questi assays richiedono abitualmente l'uso di virus wild-type e questo limita la loro applicazione quando l'oggetto dello studio è un virus umano altamente patogeno come SARS-CoV-2.
Tuttavia, i virus con deficit di replicazione utilizzati nei saggi di neutralizzazione dei virus pseudotipizzati possono essere un'alternativa sicura. Gli pseudovirus hanno una struttura conformazionale delle proteine di superficie che ricorda da vicino quella del virus nativo di interesse e hanno la stessa capacità di entrare nelle cellule utilizzando gli stessi meccanismi e recettori del virus di interesse, ma sono molto più sicuri da gestire rispetto al virus da da cui hanno avuto origine.
Le proprietà uniche degli pseudovirus consentono di maneggiarli in sicurezza nei laboratori di livello di biosicurezza (BSL) 2, che in genere lavorano con agenti che rappresentano un rischio moderato per la salute dell'uomo. Questo è un grande vantaggio, poiché virus altamente patogeni come SARS-CoV-2 richiedono laboratori BSL-3: mentre la maggior parte degli istituti di ricerca ha laboratori BSL-2, i laboratori BSL-3 sono molto meno comuni.
E, ultimo ma non meno importante: poiché il metodo si basa sulla luminescenza, ha un'elevata sensibilità e un'ampia Intervallo dinamico.
PERCHÉ UTILIZZARE STRUMENTI BERTHOLD PER I VOSTRI SAGGI DI NEUTRALIZZAZIONE DI PSEUDOVIRUS?
Berthold Technologies è il tuo partner affidabile e competente quando desideri eseguire test di neutralizzazione dei virus pseudotipizzati. Siamo orgogliosi di annoverarci tra i pionieri della misura della luminescenza e negli ultimi 4 decenni abbiamo progettato e sviluppato più di 20 diversi tipi di luminometri (dal tubo alla micropiastra). Rinomata per precisione, sensibilità e affidabilità, Berthold Technologies è ancora oggi il leader di mercato per i luminometri.
Il luminometro per micropiastre Centro LB 960 può essere utilizzato per misurare l'attività della luciferasi. È uno strumento versatile per i assays di luminescenza Glow e Flash che può essere dotato di un massimo di 3 iniettori ad alte prestazioni. È inoltre caratterizzato da un'elevata sensibilità grazie a un rigoroso processo di selezione dei fotomoltiplicatori che lavorano in modalità di conteggio dei fotoni. Grazie al suo design di riduzione della crosstalk, il Centro fornisce risultati molto affidabili. Un esempio delle sue prestazioni è mostrato nei seguenti articoli.
Un anticorpo monoclonale umano che blocca l'infezione da SARS-CoV-2
Le proteine spike naturalmente mutate delle varianti SARS-CoV-2 mostrano livelli differenziali di ingresso cellulare
Il Tristar 5 è un lettore di micropiastre modulare ad alte prestazioni dotato di filtri indipendenti e selezionabili dall'utente e di monocromatori su entrambi i lati di eccitazione ed emissione. Include una tecnologia avanzata di iniettore cell-friendly e un'ottica One-4-All per prestazioni senza compromessi di tutte le modalità di rilevamento.
Nell'articolo qui sotto, la Gaussia è stata usata come gene reporter al posto della lucciola. Il Tristar 5 ha eseguito la misurazione dell'espressione della luciferasi Gaussia.
Altre pubblicazioni
Nei seguenti articoli, le misure sono state eseguite con versioni precedenti di strumenti della famiglia dei sistemi Tristar ma possono essere trasferite 1: 1 ai nuovi sistemi Tristar.
Autore e anno | Titolo | Strumento |
|---|---|---|
| Prévost et al. (2020) | Cross-sectional evaluation of humoral responses against SARS-CoV-2 Spike | TriStar LB 941 Multimode Microplate Reader |
| Beaudoin-Bussières et al. (2020) | Decline of humoral responses against SARS-CoV-2 Spike in convalescent individuals | TriStar LB 941 Multimode Microplate Reader |
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