Panoramica delle applicazioni
Il sistema di imaging in vivo NightShade per le piante è uno strumento molto flessibile e la sua gamma di applicazioni è davvero ampia, ma ci concentreremo su alcune delle applicazioni più frequentemente utilizzate, oltre ad altre meno frequenti ma anch'esse molto interessanti, vale a dire:
- Interazione proteina-proteina
- Ritmi circadiani
- Monitoraggio dello stress
- Monitoraggio di agenti patogeni
- Altre applicazioni
Interazione proteina-proteina
La complementazione della luciferasi divisa è un metodo popolare per studiare le interazioni proteina-proteina in pianta, utilizzando un sistema di imaging in vivo per visualizzare la luminescenza sulle foglie trasformate. Si basa sulla complementazione di due frammenti scissi di una proteina luciferasi e sulla sua successiva rilevazione mediante conversione del substrato e produzione di luce. La ricostituzione della luciferasi è reversibile nella maggior parte dei casi e quindi adatta a monitorare interazioni dinamiche in tempo reale. Sia la luciferasi Firefly che la luciferasi Renilla sono state utilizzate con successo per studiare la PPI in vivo.
Il Nightshade è uno strumento molto popolare per questo metodo grazie alla sua telecamera altamente sensibile e al software flessibile.
Immagine riprodotta da Jing, Y., Liu, J., Liu, P. et al. Sci Rep 9, 5691 (2019). https://www.doi.org/10.1038/s41598-019-42177-y sotto la Creative Commons Attribution 4.0 International Public License.
Ritmi circadiani
Il monitoraggio dell'espressione dei geni coinvolti nei ritmi circadiani spesso richiede l'acquisizione di immagini durante molte ore e in condizioni di luce controllata. NightShade è lo strumento ideale per questa applicazione, grazie al suo design unico:
- Simulazione della luce diurna con qualità e intensità della luce flessibili.
- Software intuitivo con potente programmatore, che consente di programmare l'intensità e la qualità della luce desiderata per diversi giorni e di acquisire immagini nei punti temporali desiderati.
- Porte a tenuta di luce per inserire tubi per l'irrigazione e altri scopi.
- Posizione di montaggio della telecamera laterale per l'acquisizione di immagini di piante intere, dalle foglie alle radici.
- Vassoio anticondensa con controllo della temperatura per immagini di alta qualità quando si lavora con le piastre di Petri.
Ulteriori informazioni sull'imaging in vivo per la ricerca sul ritmo circadiano
Monitoraggio dello stress
Il monitoraggio dello stress nelle piante mediante l'imaging in vivo può essere effettuato in piante wild type, non modificate, grazie a due importanti proprietà:
La fluorescenza ritardata, detta anche afterglow, è la debole luce emessa da piante intatte pre-illuminate. Agisce come indicatore non solo del contenuto di clorofilla, ma anche dello stato fisiologico della pianta, che può variare in base a influenze ambientali come siccità, alti livelli salini o infezioni. Il segnale della fluorescenza immediata dura un nanosecondo, mentre la fluorescenza ritardata può essere rilevata a distanza di secondi e minuti. Nelle due immagini in alto si può notare la differenza di fluorescenza ritardata tra una pianta ben irrigata (a sinistra) e la stessa pianta dopo 2 giorni di siccità (a destra).
Inoltre, in risposta a stress come ferite, stress salino o attacchi di patogeni, viene generata un'emissione di biofotoni ultradeboli. La sua intensità è solitamente inferiore a 1000 fotoni/s*cm ed è correlata alla seconda scarica di ROS, ma è indipendente da essa. Il meccanismo molecolare alla base di questa emissione luminosa non è noto, ma offre un metodo non distruttivo e semplice per indagare i processi legati agli agenti patogeni e ad altri fattori di stress. L'emissione di biofotoni può durare per ore e l'imaging biofotonico può quindi essere eseguito una volta che la fluorescenza ritardata è svanita. Nell'immagine in basso è possibile osservare l'emissione di biofotoni in risposta a concentrazioni crescenti di cadmio. Immagine riprodotta da Jócsák, I., Malgwi, I., Rabnecz, G., Szegő, A., Varga-Visi, É., Végvári, G., Pónya, Z., 2020. PLOS ONE 15, e0240470. doi:10.1371/journal.pone.0240470 con la Creative Commons Attribution 4.0 International Public License.
Monitoraggio dei patogeni
I patogeni di interesse possono essere ingegnerizzati geneticamente per esprimere proteine bioluminescenti o fluorescenti. Questo permette di monitorare come un'infezione progredisce nel tempo, nello spazio e in risposta a diversi fattori.
L'immagine mostra un ottimo esempio di questa applicazione: la dinamica dell'infezione batterica può essere perfettamente visualizzata in tempo reale in innesti reciproci di una linea resistente (BVRC 1) e di una suscettibile (BVRC 25) dopo l'inoculazione per immersione nelle radici con il ceppo bioluminescente di R. solanacearum BL-Rs7. Riprodotto da Du, H.; Wen, C.; Zhang, X.; Xu, X.; Yang, J.; Chen, B.; Geng, S.. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 5887. doi.org/10.3390/ijms20235887 con licenza Creative Commons Attribution 4.0 International Public License.
Il NightShade è molto adatto a questa applicazione, grazie al suo potente software di programmazione e all'elevata sensibilità, che consente di visualizzare il patogeno anche nelle fasi iniziali dell'infezione.
Altre applicazioni
E ci sono molte altre possibili applicazioni del NightShade:
- Naturalmente, la visualizzazione dei modelli di espressione genica. L'esclusiva posizione laterale della telecamera di NightShade consente di visualizzare l'intera pianta, dalla radice alle foglie, senza problemi di geotropismo in esperimenti di lunga durata.
- Anche lo screening dell'espressione genica è un'applicazione molto diffusa: sono disponibili diversi portacampioni per un massimo di 9 piastre di Petri, che consentono di analizzare molte piantine in poco tempo. L'immagine in alto mostra un esempio di screening di mutanti (riprodotto da Thatcher, L.F., Foley, R., Casarotto, H.J. et al. Sci Rep 8, 13454 (2018). https://doi.org/10.1038/s41598-018-31837-0 con licenza Creative Commons Attribution 4.0 International Public License).
- La flangia multiporta personalizzabile apre un mondo di possibilità: avete bisogno di irrigare le piante all'interno della camera oscura? Nessun problema. Avete bisogno di guide di luce per un'illuminazione personalizzata? Facile. Avete bisogno di toccare le piante per studiare i geni sensibili al tatto? Perché no!
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