Perché usare un monocromatore in un lettore di micropiastre?
I lettori di micropiastre vengono utilizzati in un'ampia gamma di metodi in molti campi scientifici. Le applicazioni che utilizzano la luminescenza non richiedono alcun mezzo per la selezione della lunghezza d'onda perché tutti i fotoni vengono raggruppati insieme per fornire la luminescenza del campione. Altri metodi richiedono la capacità di limitare le lunghezze d'onda misurate a una larghezza di banda ridotta: ad es. misurare l'assorbimento intorno al massimo di assorbimento della sostanza di interesse, eccitando un solo fluoroforo o separando l'emissione di diverse proteine reporter.
Tradizionalmente, i filtri vengono utilizzati per selezionare la lunghezza d'onda desiderata per il dosaggio. Sono convenienti, facili da usare e offrono un'elevata sensibilità grazie alle loro elevate proprietà di trasmissione e blocco. Tuttavia, mancano di flessibilità poiché l'uso di lunghezze d'onda diverse richiede l'uso di diversi set di filtri. Inoltre non sono adatti per misurare lo spettro di una sostanza. Ulteriori informazioni sul principio e sui tipi di monocromatori.
I monocromatori vengono utilizzati nei lettori di micropiastre principalmente per misurare l'assorbanza e l'intensità della fluorescenza.
Le specifiche del monocromatore più rilevanti per i lettori di micropiastre
Gamma spettrale (gamma di lunghezze d'onda)
Molti lettori di micropiastre sul mercato coprono un intervallo di assorbimento da 230 nm a 1000 nm. Con i nostri sistemi è possibile utilizzare il monocromatore fino a 200 nm. Quando si misura la fluorescenza, molti lettori di micropiastre possono misurare solo fino a 700 o 740 nm. I nostri strumenti possono coprire la gamma fino a 850 nm.
Lunghezza d’onda spettrale
La larghezza di banda spettrale (chiamata anche passa banda spettrale) è definita come l'ampiezza nei punti in cui la luce ha raggiunto la metà del valore massimo (larghezza intera a metà massimo, abbreviato FWHM). La larghezza della fessura determina la larghezza di banda spettrale: maggiore è la larghezza della fessura, più stretta è la larghezza di banda spettrale. Molti lettori di micropiastre sul mercato hanno una larghezza di banda spettrale fissa. Tuttavia, i nostri lettori di micropiastre, dotati di monocromatore, hanno tutti una larghezza di banda variabile: da 4 nm (o 6, a seconda del dispositivo) a 22 nm. Una larghezza di banda più stretta migliora la risoluzione ed è consigliata per la fluorescenza quando i picchi di eccitazione ed emissione sono molto vicini tra loro. Una larghezza di banda più ampia migliora il rapporto segnale / disturbo. Un monocromatore con larghezza di banda spettrale variabile è molto utile per ottimizzare i assays complicati.
L'efficienza del sistema di blocco
L'efficienza del sistema di blocco è la capacità di un sistema di selezione della lunghezza d'onda di bloccare lunghezze d'onda indesiderate (diverse dalla gamma selezionata nel monocromatore) ed è fondamentale per ottenere un buon rapporto segnale-disturbo. È espresso come la frazione di luce indesiderata che esce dal monocromatore. Un'efficienza di blocco di 10-3 significa che 1/1000 della luce di lunghezze d'onda indesiderate non viene bloccata ed esce dal monocromatore. La maggior parte dei lettori di micropiastre utilizza una configurazione a doppio monocromatore per ottenere un'efficienza di blocco di 10-6 richiesta per la maggior parte degli assays di intensità di fluorescenza.
Luce dispersa
La luce dispersa è la quantità di luce misurata che esce dal monocromatore a una lunghezza d'onda diversa dalla lunghezza d'onda selezionata. È la radiazione che è il risultato di imperfezioni nell'elemento disperdente o in altre superfici ottiche, effetti di diffrazione, altre aberrazioni ottiche o componenti danneggiati e usurati.
Nelle misure dell'assorbanza la luce dispersa causa deviazioni dalla legge di Lambert-Beer. A valori di assorbimento elevati la relazione lineare tra assorbimento e concentrazione è fortemente influenzata dal fattore della luce dispersa. Ciò introduce un bias sistematico verso assorbimenti inferiori a concentrazioni crescenti. La luce dispersa è anche il parametro di influenza principale per il limite superiore dell'intervallo dinamico lineare per un'analisi e causerà anche problemi nelle misurazioni della fluorescenza.
La luce dispersa è espressa come frazione della luce che esce dal monocromatore: un indice di 10-4 significa che 1/10000 della luce che esce dal monocromatore è luce dispersa.
Mentre la maggior parte dei lettori di micropiastre sul mercato ha un indice di luce dispersa tra 3 x 10-4 e 5 x 10-4, gli strumenti prodotti da Berthold Technologies presentano un eccellente indice di 10-6, questo è almeno 20 volte migliore, fornendo la massima affidabilità in tutte le misurazioni basate sul monocromatore.
Risoluzione spettrale
La risoluzione è il passa banda minimo impostabile nel monocromatore; fissati gli elementi monocromatori e le loro posizioni la risoluzione è determinata dalla larghezza minima della fessura. La risoluzione è fondamentale per determinare con precisione lo spettro di un campione. I picchi spettrali originariamente nitidi si ampliano quando misurati a bassa risoluzione e possono persino scomparire utilizzando un'ampia larghezza della fessura. Una fessura stretta raggiunge una forma dello spettro più vicina allo spettro originale. Nella Figura 1 si può vedere un esempio dell'impatto che la risoluzione ha in una scansione spettrale: con una risoluzione di 4 nm i 3 picchi intorno a 500 nm sembrano più piatti che a 1 nm ma sono comunque facilmente distinguibili; con una risoluzione di 15 nm appaiono fusi come un unico picco, con conseguente perdita di informazioni potenzialmente importanti.
I monocromatori utilizzati nei nostri lettori di micropiastre hanno una risoluzione spettrale di 4 o 6 nm a seconda del dispositivo. Mentre molti concorrenti hanno solo una risoluzione di fluorescenza di 9, 15 o talvolta 20 nm.
Quando misurare con i filtri e quando si utilizza un monocromatore?
Dipende dal dosaggio. Per alcune misure come i filtri di polarizzazione della fluorescenza devono essere utilizzati perché la luce polarizzata in un monocromatore non può essere facilmente regolata. In altri test come BRET la sensibilità richiesta sarà difficile da ottenere utilizzando monocromatici.
In generale, le misurazioni effettuate con i filtri forniscono una sensibilità maggiore rispetto alle stesse misurazioni effettuate con un monocromatore in uno strumento comparabile. In molti casi la sensibilità offerta da un monocromatore è abbastanza buona, hanno una maggiore flessibilità e la comodità della selezione della lunghezza d'onda a volte è preferibile.
I lettori di micropiastre basati su monocromatori di Berthold Technologies offrono il meglio di entrambi i mondi. Sei libero di scegliere tra filtri e monocromatore fornendo l'opzione che offre le migliori prestazioni per il tuo dosaggio.