COS'È LA LUMINESCENZA? DEFINIZIONE DI LUMINESCENZA
Con il termine luminescenza si intende l'emissione di luce che non è causata da un'elevata temperatura. Il fenomeno è quindi conosciuto anche come "luce fredda".
Ci sono molti processi che emettono luce intorno a noi. Sono presenti in natura o prodotti artificialmente. Esempi di luminescenza naturale includono lucciole e fitoplancton (bioluminescenza). I diodi emettitori di luce (LED) e i monitor dei computer (elettroluminescenza) sono esempi di luminescenza artificiale.
TIPI DI LUMINESCENZA
Nelle scienze della vita vengono utilizzati diversi tipi di luminescenza. I diversi tipi di luminescenza possono essere raggruppati in base a due diversi criteri: per modalità di eccitazione della sostanza e per durata di emissione del segnale.
A. Tipi di luminescenza mediante il metodo di generazione della sostanza ad alta energia:
La maggior parte dei tipi di luminescenza coinvolgono una sostanza ad alta energia che perde energia sotto forma di luce. Il meccanismo attraverso il quale questa sostanza viene generata o ottiene l'energia “extra” da rilasciare sotto forma di luce è un modo utile per classificare la luminescenza.
1. Chemiluminescenza
La chemiluminescenza descrive l'emissione di luce come risultato di una reazione chimica. L'entalpia di reazione fornisce l'energia richiesta, producendo un prodotto eccitato o intermedio. Quando l'intermedio cade nel suo stato fondamentale, emette un fotone.
1.1 Bioluminescenza
Se una tale reazione avviene in un organismo vivente, ad es. nelle lucciole, questo si chiama bioluminescenza. Questa reazione biochimica coinvolge una molecola che emette luce chiamata luciferina e un enzima chiamato luciferasi. Le luciferasi sono una famiglia di fotoproteine che possono essere trovate in vari insetti, organismi marini e procarioti [1]. Questi enzimi catalizzano l'ossidazione della luciferina, con conseguente emissione di fotoni. A seconda dell'organismo, l'enzima e il substrato prodotti, nonché i cofattori necessari, sono diversi. Di conseguenza, la lunghezza d'onda di emissione della luce prodotta varia producendo spettri di emissione compresi tra 400 nm e 620 nm.
Una delle luciferasi più comunemente utilizzate nelle scienze della vita è la luciferasi della lucciola, che emette luce giallo-verde a circa 550 – 570 nm. Un altro ottimo esempio è la Renilla Luciferasi della "viola del mare" Renilla reniformis, che emette luce blu a 480 – 500 nm.
2. Fotoluminescenza
La fotoluminescenza descrive la luminescenza di una sostanza eccitata (cioè portata ad un livello energetico più elevato) dalla luce, solitamente ultravioletta o visibile. Questa si chiama fotoeccitazione ed è il risultato dello spostamento degli elettroni a livelli energeticamente più elevati attraverso l'assorbimento di fotoni. Come risultato dell'eccitazione, di solito si verificano vari processi di rilassamento in cui vengono riemessi fotoni di energia tipicamente inferiore. Fluorescenza e fosforescenza sono i principali tipi di fotoluminescenza e una molecola con proprietà fluorescenti è chiamata fluoroforo. Nelle scienze della vita, questa forma di luminescenza è più comunemente utilizzata nei test di fluorescenza.
BRET e FRET implicano un tipo speciale di trasferimento di energia che potrebbe essere considerato una forma di fotoluminescenza. In entrambi i metodi ci sono due molecole o gruppi, un donatore e un accettore, il donatore essendo una luciferasi (in BRET) o un fluoroforo (in FRET), e l'accettore essendo un fluoroforo che può essere eccitato alla lunghezza d'onda di emissione del donatore. L'eccitazione dell'accettore da parte del donatore ricorda la fluorescenza, tuttavia, sia in BRET che in FRET, l'energia in eccesso viene trasportata all'accettore attraverso un processo non radiativo sotto forma di fotone virtuale emesso: questo trasferimento è facilitato dal dipolo -accoppiamenti dipolari tra le molecole e si chiama risonanza. Il termine virtuale è indicativo del fatto che il fotone viene riassorbito prima che le sue proprietà, come la lunghezza d'onda, assumano un significato fisico [3].
3. Elettroluminescenza
L'elettroluminescenza descrive la generazione di luce come risultato di una corrente elettrica fatta passare attraverso una sostanza. Nelle scienze della vita viene tipicamente utilizzata in alcune forme di test immunologici e in immunochimica per applicazioni cliniche.
Il test immunologico elettrochemiluminescente (ECLIA) [2] è un metodo altamente sensibile in cui un intermedio elettrochimico viene generato da precursori stabili (ad esempio, l'etichetta attiva ECL) sulla superficie di un elettrodo. La molecola emette luce quando è rilassata a un livello energetico inferiore.
4. Radioluminescenza
La radioluminescenza si verifica quando determinate sostanze vengono colpite da radiazioni ionizzanti come i raggi α, β o γ. Nel recente passato (anni '60) questo fenomeno veniva utilizzato per far brillare al buio i quadranti degli orologi.
Questo principio viene applicato per la separazione e il rilevamento di traccianti radioattivi mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (radio HPLC) in varie applicazioni farmaceutiche e cliniche. Nella radio HPLC, un elettrone colpisce una molecola scintillatrice e la solleva ad un livello energetico più elevato. Lo scintillatore ritorna immediatamente al suo livello energetico iniziale emettendo fotoni. Questi fotoni vengono rilevati da un tubo fotomoltiplicatore (PMT).
Nel campo delle scienze della vita il termine “luminescenza” viene spesso utilizzato per riferirsi alla chemiluminescenza (e, per estensione, alla bioluminescenza) in contrapposizione alla fluorescenza. Ma, come hai visto sopra, la fluorescenza è un sottotipo di luminescenza. Scopri di più sulle differenze tra luminescenza, fluorescenza e fosforescenza. Poiché questa è la consueta convenzione nel settore, nel resto dell'articolo utilizzeremo il termine luminescenza per riferirci alla chemiluminescenza e alla bioluminescenza, se non diversamente specificato.
B. Tipi di luminescenza per durata dell'emissione del segnale
1. Luminescenza "flash"
I test che producono un segnale breve ma solitamente forte sono chiamati test flash. L'emivita del segnale di questi test è tipicamente nell'ordine di pochi minuti o anche meno. La sfida con i test flash è che una volta aggiunto il reagente del test, il segnale raggiunge il picco quasi immediatamente e poi diminuisce rapidamente. Questo non è un problema quando si utilizza un luminometro a tubo singolo, poiché ogni campione può essere misurato individualmente immediatamente dopo l'aggiunta del reagente iniziale. Ma che ne dici di misurare invece in un luminometro per micropiastre?
Se si avviasse la reazione in tutti i pozzetti contemporaneamente in una piastra da 96 pozzetti e poi si misurasse in sequenza, solo i primi pozzetti verrebbero misurati al picco dell'intensità del segnale. Nei pozzetti misurati successivamente, tuttavia, l'intensità del segnale di luminescenza sarebbe già notevolmente ridotta.
Pertanto, la misurazione dei test flash in un lettore di micropiastre richiede l'uso dei cosiddetti iniettori. In questo modo è possibile aggiungere prima il reagente starter in ciascun pozzetto e misurare immediatamente il segnale. Il test Dual-Luciferase Reporter™ e i test SPARCL sono entrambi esempi di test di tipo flash.
2. Luminescenza "Glow"
I test di tipo Glow, invece, hanno un'intensità del segnale che dura per ore. Sebbene l'intensità del segnale sia ridotta, il flusso di lavoro molto più semplice dovuto alla maggiore intensità del segnale, che non richiede iniettori di reagenti, rende spesso questa forma di analisi in luminescenza il metodo di scelta. Tuttavia, poiché tutti i pozzi emettono luce contemporaneamente, è possibile che la luce proveniente dai pozzi adiacenti interferisca nella misurazione, in un fenomeno chiamato crosstalk (vedi sotto).