La lettura “top” è solitamente più sensibile
La lettura dall'alto di solito fornisce migliori rapporti segnale-disturbo per assays basati su soluzioni come la quantificazione del DNA o la quantificazione delle proteine. In generale, la lettura della fluorescenza dall'alto è più sensibile della lettura dal basso. Questo è il risultato della luce che viene attenuata e dispersa dalla plastica del fondo del pozzetto che può aumentare lo fondo e diminuire l'efficienza della misura. La qualità e lo spessore della plastica trasparente inferiore e il tipo di fluoroforo sono considerazioni importanti quando si progetta il test.
Il tipo di micropiastra è fondamentale per la lettura “bottom”
Un altro fattore da considerare è il tipo di piastra a fondo trasparente che stai utilizzando. Stai usando una piastra per coltura tissutale a parete opaca? Il piatto è bianco o nero? Il fondo trasparente è in polystyrene o vetro?
La risposta alle domande di cui sopra è strettamente collegata alla lunghezza d'onda di interesse. Se stai cercando di rilevare la luce visibile tra 350-900 nm, un fondo di plastica andrà generalmente bene. Il rilevamento al di sotto di 350 nm richiede un fondo in materiale trasparente ai raggi UV di quarzo o moderni polimeri COP / COC. È possibile utilizzare piastre inferiori in vetro ottico più costose che consentono il rilevamento sia dall'alto che dal basso nonché la visualizzazione microscopica delle celle con fondo basso.
La differenza fondamentale tra piastre bianche e nere è la loro proprietà riflettente. Le piastre bianche riflettono la luce e massimizzano il segnale di uscita della luce principalmente in luminescenza. Mentre le piastre nere assorbono la luce, che riducono il fondo e il crosstalk, vengono utilizzate per le analisi fluorescenti.
Quando la lettura “bottom” fornisce risultati migliori?
- Quando si lavora con cellule aderenti che crescono sul fondo della piastra ed esprimono, si legano o secernono un fluoroforo che si trova vicino al fondo della piastra.
- Gli assays chemiotassi che monitorano la migrazione delle cellule attraverso una membrana vengono analizzati mediante una combinazione di letture top e bottom.
- Alcuni assays basati su cellule, come l'assorbimento di acidi grassi GeneBLAzer® o QBT ™, non possono essere letti dall'alto poiché le proprietà ottiche dei buffers utilizzati negli assay interferiscono con l'eccitazione o l'emissione del fluoroforo.
In caso di dubbi sulla tecnologia di lettura da utilizzare, è possibile programmare il lettore di micropiastre in modo che esegua un protocollo che includa sia la lettura top che la lettura bottom. Quindi confronta i risultati per prendere la decisione finale.
GeneBLAzer® è un marchio registrato di Invitrogen Corporation.
QBT ™ Fatty Acid Uptake è un marchio di Molecular Devices.