Il termine fluorescenza in tempo risolto (Time-Resolved Fluorescence - TRF) può essere utilizzato con due diversi significati:

  1. La fluorescenza di un campione monitorata in funzione del tempo dopo l'eccitazione da un impulso di luce. Per chiarire le ambiguità, questa procedura è spesso chiamata misura della durata della fluorescenza (Fluorescence Lifetime measurement).
  2. L'uso di fluorofori con una durata di fluorescenza distintiva per evitare l'interferenza causata da molecole con una durata di fluorescenza molto diversa o altri fattori come la luce di eccitazione.

Quando si discute dei lettori di micropiastre, TRF di solito fa riferimento al secondo significato.

 

     

    I fluorofori scelti sono solitamente chelati di lantanidi e più comunemente Europio, Terbio e Samario, a causa delle seguenti proprietà:

    • La sua durata di fluorescenza è dell'ordine dei microsecondi (μs), mentre nella maggior parte dei fluorofori la durata della sua fluorescenza è dell'ordine dei nanosecondi (ns). Ciò consente di eseguire la misura molto dopo che sia la luce dell'eccitazione che la fluorescenza di qualsiasi altro fluoroforo nel campione sono completamente decadute, riducendo notevolmente il fondo e aumentando così il rapporto segnale-disturbo ratio.
    • La grande differenza tra la sua eccitazione e le lunghezze d'onda di emissione (Stokes' shif) e gli stretti picchi di emissione contribuiscono ad aumentare ulteriormente il rapporto segnale-disturbo ratio.

    APPLICAZIONI DELLA FLUORESCENZA IN TEMPO RISOLTO

    L'ampio rapporto segnale-disturbo ratio dei metodi basati su TRF fornisce una sensibilità molto elevata. Di conseguenza, sono stati sviluppati molti assays che utilizzano le proprietà di fluorescenza in tempo risolto dei chelati di lantanidi. Il tipo di analisi più popolare che utilizza TRF sono le analisi TR-FRET. La durata della fluorescenza distintiva e le proprietà spettrali dei diversi chelati di lantanidi consentono di sviluppare assays multiplex.

     

    Transcreener® GDP TR-FRET Red Assay with Mithras² Validation of the Mithras² Multimode Microplate Reader with the Transcreener® GDP TR-FRET Red assay

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    Transcreener® GDP TR-FRET Red Assay with TriStar² S Validation of the TriStar² S Multimode Microplate Reader with the Transcreener® GDP TR-FRET Red assay

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    cAMP/IP-One HTplex HTRF® assay with Mithras cAMP/IP-One HTplex cell-based experiment performed on Mithras LB 940 Multimode Microplate Reader using HTRF® technology

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    LETTORI DI MICROPIASTRE ADATTI A TRF

    Un lettore di micropiastre in grado di misurare la fluorescenza ad alta sensibilità tramite filtri e dotato di lampada flash è la migliore combinazione per TRF (può essere utilizzato anche uno strumento basato sul monocromatore, ma con prestazioni inferiori); per alcune applicazioni può essere necessario un rivelatore con un intervallo spettrale esteso (superiore a 650 nm). Tutti i lettori di micropiastre riportati di seguito sono consigliati per TRF.