Il FRET risolto in tempo risolto combina le metodologie in tempo risolto con il FRET classico per creare assays di elevata robustezza e sensibilità:

  • FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) si basa sul fatto che un fluoroforo donatore (ad esempio CFP) in uno stato eccitato può trasferire una parte della sua energia a una molecola accettrice come YFP. L'emissione dall'accettore può essere rilevata non appena entrambi i fluorofori sono in stretta vicinanza quando ad es. si è verificata l'interazione di due proteine. Le prestazioni dei test FRET tradizionali sono spesso ostacolate dalla fluorescenza di fondo dei componenti del campione, ma questo tipo di fluorescenza di fondo è estremamente transitoria (con una durata nel range dei nanosecondi) e può quindi essere eliminata utilizzando metodologie a tempo risolte.
  • La fluorescenza in tempo risolto (TRF) utilizza fluorofori con una durata di fluorescenza molto lunga per evitare l'interferenza causata da molecole con una durata di fluorescenza breve o altri fattori (soprattutto, luce di eccitazione). I fluorofori scelti sono generalmente chelati di lantanidi (più comunemente Europio, Terbio e Samario).

Una potente variante di TR-FRET è HTRF®.

APPLICAZIONI DI TR-FRET

In alternativa a FRET, il TR-FRET viene spesso utilizzato per studiare le interazioni proteina-proteina. Tuttavia, sono stati sviluppati molti altri assays che misurano il legame tra due macromolecole.

 

Transcreener® GDP TR-FRET Red Assay with Mithras² Validation of the Mithras² Multimode Microplate Reader with the Transcreener® GDP TR-FRET Red assay

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Transcreener® GDP TR-FRET Red Assay with TriStar² S Validation of the TriStar² S Multimode Microplate Reader with the Transcreener® GDP TR-FRET Red assay

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cAMP/IP-One HTplex HTRF® assay with Mithras cAMP/IP-One HTplex cell-based experiment performed on Mithras LB 940 Multimode Microplate Reader using HTRF® technology

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LETTORI DI MICROPIASTRE CONSIGLIATI PER TR-FRET

Un lettore di micropiastre è in grado di misurare la fluorescenza con alta sensibilità utilizzando filtri e, dotato di una lampada flash, è la migliore combinazione per TRF (può essere utilizzato anche uno strumento basato sul monocromatore, ma con prestazioni inferiori). Per alcune applicazioni potrebbe essere necessario un rivelatore con un intervallo spettrale esteso (superiore a 650 nm). Ad esempio, alcuni popolari assays TR-FRET misurano il marcatore Europium a 665 nm. Tutti i lettori di micropiastre riportati di seguito sono consigliati per TR-FRET.

HTRF® è un marchio registrato di Cisbio Bioassays.