Un gene è costituito da due elementi funzionali principali: il primo luogo è costituito da una cosiddetta sequenza di DNA codificante che fornisce informazioni sulla proteina prodotta. In secondo luogo, una sequenza promotore specifica legata alla regione codificante che regola la trascrizione del gene. Il promotore serve per attivare o sopprimere l'espressione del gene come richiesto.
Lo scopo principale del assay del gene reporter è indagare il promotore di un gene di interesse, ovvero la regolazione della sua espressione. Questo può essere fatto collegando il promotore di interesse a un gene facilmente rilevabile, come il gene per la luciferasi di lucciola, che catalizza una reazione che produce luce.
Di solito, le cellule vengono quindi esposte a diversi fattori o condizioni, oppure possono essere apportate modifiche nell'ordine del reporter, il cui effetto può essere facilmente monitorato misurando i cambiamenti nell'emissione di luce.
ESEMPI DI GENI REPORTER
I geni reporter comuni sono β-galattosidasi, β-glucuronidasi e luciferasi. Vari metodi di rilevamento (vedi sotto) vengono utilizzati per misurare la proteina del gene reporter espressa. Questi includono luminescenza, assorbanza e fluorescenza.
I assays basati sulla luminescenza sono molto popolari per diversi motivi:
- hanno un'elevata sensibilità (tra 10 e 10.000 volte superiore ai metodi basati sull'assorbimento o sulla fluorescenza, a seconda dell’ assay specifica e del reporter utilizzato) la maggior parte dei tipi di cellule non ha attività luciferasi endogena
- gli assays di luminescenza hanno un ampio intervallo dinamico sono veloci da eseguire
- i loro costi sono relativamente bassi
Gli assays reporter luminescenti vengono misurati utilizzando un luminometro.
Geni reporter mediante metodo di rilevamento
| Reporter | Luminescence | Fluorescence | Absorbance |
|---|---|---|---|
| Luciferase | |||
β-Galattosidasi (β-Gal) | |||
β-glucuronidasi (β-GUS) | |||
Fosfatasi alcalina secreta (SEAP) | |||
Proteina fluorescente verde (GFP) |
Firefly Luciferasi
Il gene reporter più versatile e comune è la luciferasi della lucciola (firefly) nordamericana Photinus pyralis. La proteina non richiede una modificazione post-traduzionali per l'attività enzimatica. Non è tossico in vivo, nemmeno ad alta concentrazione e può essere utilizzato sia nelle cellule procariotiche che in quelle eucariotiche. La Firefly luciferasi catalizza l'ossidazione bioluminescente della luciferina in presenza di ATP, Magnesio e Ossigeno.
Dual-Luciferase® Reporter Gene Assay
Il saggio Dual-Luciferase® Reporter (DLR) assay system contiene due diversi enzimi reporter della luciferasi espressi simultaneamente in ciascuna cellula. La Firefly luciferasi (lucciola) e laRenilla luciferasi (octocorallo coloniale) possono discriminare tra i rispettivi substrati di bioluminescenza e non si attivano in modo incrociato. La Firefly luciferasi è controllata dal promotore di interesse e la Renilla luciferasi da un promotore che fornisce un'espressione stabile; in questo modo l'espressione della Renilla luciferasi può essere utilizzata come controllo interno per compensare eventuali variabili sperimentali causate da diverso numero di cellule, efficienza di trasfezione e altri errori. Sebbene ciò sia molto conveniente, è necessario prestare attenzione per garantire che nessuna delle condizioni assayed modifichi l'espressione della Renilla luciferasi, poiché ciò potrebbe portare a false conclusioni.
Nuove luciferasi
Negli ultimi anni sono state utilizzate altre luciferasi per gli assay del gene reporter, come le luciferasi Gaussia, Cypridina o NanoLuc®. Queste cosiddette luciferasi "nuove" sono fino a 1000 volte più luminose delle luciferasi Firefly o Renilla e di solito hanno altri vantaggi, ad esempio stabilità migliorata, dimensioni più piccole e secrezione extracellulare.
Note applicative relative ai geni reporter
DLR Assay (Promega) with the Orion II Dual Luciferase Reporter Assay (Promega) with the Orion II Microplate Luminometer
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Monitoring of Renilla Luciferase Activities in-vitro and in-vivo The expression of a novel EnduRen™ and ViviRen™ Renilla luciferase reporter gene (Promega) in vitro and in vivo is explored
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Bioluminescence Imaging using NightOWL Bioluminescence Imaging using NightOWL LB 981 NC 100. Cells expressing luciferase gene under the control of a constitutive promoter were used as a model of in vivo proliferation of cancer cells.
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Luciferin bioavailability in mice during in-vivo imaging To determine the optimal luciferase activity detection time, time course experiments were performed.
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Circadian Clock with NightSHADE Getting to Know The Circadian Clock and Plant Growth With NightSHADE
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Analysis of circadian rhythms using NightShade Improved experimental setup for analysis of circadian rhythms using the NightShade Plant In Vivo Imaging System
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DLR™ VALIDATION OF THE TRISTAR 3 Validation of the Tristar 3 with the Dual-Luciferase® Reporter System from Promega.
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DLR™ VALIDATION OF THE TRISTAR 5 Validation of the Tristar 5 for the Dual-Luciferase® Reporter System from Promega.
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DLR™ VALIDATION OF THE CENTRO LB 963 Validation of the Centro LB 963 for the Dual-Luciferase® Reporter System from Promega.
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Strumenti consigliati per gli assays gene reporter
Dual-Luciferase e NanoLuc sono marchi registrati di Promega Corp.