L'IMPORTANZA DELLA MISURA DEL CALCIO INTRACELLULARE
Il calcio bivalente è un messaggero intracellulare in molte vie di trasduzione del segnale eucariotico. La maggior parte dei sistemi di segnalazione del calcio (calcium-signaling systems) hanno una cosa in comune: generano brevi impulsi di calcio, regolando così le funzioni cellulari.
I livelli intracellulari di calcio sono generalmente mantenuti bassi, poiché il calcio spesso forma complessi insolubili con composti fosforilati e carbossilati. Tipicamente, le concentrazioni di calcio citosolico sono 100 nM. In risposta agli stimoli, il calcio viene rilasciato dal mezzo esterno o dalle riserve interne per aumentare la concentrazione di calcio.
MISURA DEL CALCIO INTRACELLULARE MEDIANTE LA LUMINESCENZA
Il monitoraggio delle variazioni dei livelli di calcio intracellulare mediante Equorina in una reazione luminescente di tipo flash è altamente efficiente. Assays per entrambi, l'attivazione dei recettori accoppiati a proteine G (noti anche come recettori GPCR o 7TM) che inducono la degradazione dei fosfolipidi dell'inositolo e l'attività dei canali ionici del calcio voltaggio-dipendenti - questi ultimi causando un afthroughput piuttosto lento - possono essere facilmente eseguiti con il utilizzo degli iniettori di reagente del luminometro Centro e dei lettori di micropiastre Tristar.
MISURAZIONE DEL CALCIO INTRACELLULARE MEDIANTE LA FLUORESCENZA
La concentrazione di calcio libero nelle cellule intatte può essere monitorata utilizzando chelanti policiclici come Fura-2 o Indo-1. Fura-2 e Indo-1 forniscono una lettura raziometrica, riducendo così gli effetti causati dalla fuoriuscita di coloranti o sbiancati o da condizioni di assay variabili.
Le proprietà di fluorescenza di entrambi i coloranti sono notevolmente modificate quando il calcio è legato e quindi è possibile la rilevazione diretta dei flussi di calcio in risposta a specifiche vie di trasduzione del segnale. Il massimo di emissione da Indo-1 passa da ~ 475 nm in mezzo privo di calcio a ~ 400 nm quando il colorante è saturo di calcio. Con Fura-2, l'assorbimento massimo di Fura-2 passa da 380 nm a 340 nm quando si lega il calcio, mentre l'emissione rimane costante a 510 nm. Ciò si traduce in un cambiamento opposto dell'intensità della fluorescenza: un aumento a 340 nm e una diminuzione a 380 nm.
Il cambio del filtro nei nostri lettori di micropiastre multimodali è estremamente veloce (~ 150 ms), consentendo così un'elevata risoluzione di rilevamento quando devono essere monitorati rapidi cambiamenti nella concentrazione di calcio. Utilizzando almeno un iniettore situato in posizione di lettura, è possibile monitorare la cinetica di reazione rapida.
L'agente fluorescente Fluo-4 può anche essere utilizzato per monitorare i cambiamenti del calcio intracellulare e ha il vantaggio di utilizzare una singola misura, quindi non è necessario cambiare il filtro. Ciò è utile se le variazioni dei livelli di calcio intracellulare sono troppo rapide per lo strumento utilizzato (ad esempio, se si utilizza un monocromatore o se ha un cambio lento del filtro). Tuttavia, non è raziometrico e quindi è più soggetto a condizioni di assay variabili, perdite e sbiancamento.
NOTE APPLICATIVE RELATIVE AL CALCIO INTRACELLULARE
Calcium monitoring with the Mithras Calcium monitoring using Fura-2 with the Mithras LB 940 multimode plate reader
PDF | 1.2 MB
Intracellular Ca2+ with Clonetics™ Primary Sensors and the Orion II Monitoring Intracellular Ca2+ Fluxes with Clonetics™ Primary Sensors using the Orion II Microplate Luminometer
PDF | 333.6 KB
Screening of GPCR antagonists using Ca2+ measurements and the TriStar² S 3 commercially available compounds are screened for P2Y2 receptor inhibition using the calcium mobilisation assay with two different fluorescent dyes measured on a TriStar² LB 942 multimode microplate reader.
PDF | 1,009.5 KB
STRUMENTI CONSIGLIATI PER LE MISURE DI CALCIO INTRACELLULARE
Come accennato in precedenza, gli iniettori in posizione di misura sono consigliati per le misure intracellulari che utilizzano la luminescenza e filtri a selezione rapida per le misure che utilizzano la fluorescenza. Tutti i lettori di micropiastre riportati di seguito soddisfano tali raccomandazioni.
I luminometri a tubo dotati di iniettori possono essere utilizzati anche per la misura del calcio intracellulare mediante luminescenza e sono adatti anche se la produttività del campione è bassa. Nei luminometri a tubo, gli iniettori sono sempre in posizione di misura.