PRINCIPIO DI FRET

FRET si basa sul fatto che una molecola fluorescenti donatore (ad esempio CFP) in uno stato eccitato può trasferire una parte della sua energia attraverso l'accoppiamento dipolo-dipolo non radiativo a una molecola accettrice come YFP. La tecnologia prevede la fusione di proteine fluorescenti donatrici e accettori a molecole di interesse. La co-espressione dei costrutti di fusione nelle cellule viventi consente di studiare la loro interazione in tempo reale in modo quantitativo. L'emissione dall'accettore può essere rilevata non appena entrambi i coloranti sono in stretta vicinanza, ad es. quando si è verificata l'interazione di due proteine.

APPLICAZIONI FRET

FRET viene utilizzato analiticamente per molti assays dove la struttura di una macromolecola cambia o il legame di un ligando a una macromolecola è di interesse, specialmente nello studio delle interazioni proteina-proteina.

FRET to Study GPCR Oligomerization with Mithras FRET as a Tool to Study G-protein Coupled Receptor Oligomerization in HEK Cells.

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ALTERNATIVE AL FRET

Una limitazione di FRET è il requisito per l'illuminazione esterna per avviare il trasferimento di fluorescenza, che può portare a un rumore di fondo nei risultati dall'eccitazione diretta dell'accettore o al photobleaching. Per evitare questo inconveniente, sono stati sviluppati diversi metodi alternativi:

  • Il trasferimento di energia di risonanza della bioluminescenza (BRET) utilizza una luciferasi bioluminescente come donatore, risultando in uno rumore di fondo molto basso.
  • Time-Resolved FRET (TR-FRET) utilizza un approccio diverso per evitare interferenze: utilizza fluorofori con una durata di fluorescenza molto lunga per evitare l'interferenza causata da molecole con una durata di fluorescenza breve o altri fattori (soprattutto, luce di eccitazione). I fluorofori scelti sono generalmente chelati di lantanidi (più comunemente Europio, Terbio e Samario). Ciò si traduce in analisi di elevata robustezza e sensibilità ed è popolare tra i produttori di kit per sviluppare analisi che misurano le interazioni molecolari.

LETTORI DI MICROPIASTRE CONSIGLIATI PER FRET

Un lettore di micropiastre ad alta sensibilità in grado di misurare la fluorescenza utilizzando filtri è la migliore combinazione per FRET. Possono essere utilizzati lettori con monocromatori, ma ottenendo prestazioni inferiori. È necessario effettuare 2 misure a diverse lunghezze d'onda, quindi è necessario uno strumento con almeno 2 filtri di emissione (ciò non è possibile, ad esempio, negli strumenti che utilizzano un filtro a cubo singolo con 1 filtro di eccitazione + 1 filtro di emissione). Tutti i lettori di micropiastre riportati di seguito sono consigliati per FRET.