PUREZZA DEL DNA NELLA SPETTROFOTOMETRIA UV
Come abbiamo descritto nella discussione sui metodi di quantificazione del DNA, misurare l'assorbanza di un campione a 260 nm è un metodo ampiamente utilizzato per quantificare la concentrazione del DNA. Tuttavia, altre macromolecole assorbono a 260 nm: principalmente proteine e RNA, ma anche sostanze utilizzate per la purificazione. La contaminazione del campione da parte di sostanze che assorbono a 260 nm porta ad una sovrastima della quantità di DNA e quindi possibilmente ad una concentrazione di DNA inferiore a quella richiesta per una successiva procedura a valle. Molte di queste impurità possono essere stimate misurando l'assorbimento del campione a lunghezze d'onda diverse da 260 nm.
A340
L'elevata assorbanza a circa 340 nm (o 320 nm) è un indicatore di particelle in sospensione. Poiché normalmente non influenzano alcun metodo a valle, l'A340 viene solitamente sottratto dalla misura dell'assorbanza solo per correggere l'influenza delle particelle sulla quantificazione. Questa sottrazione viene talvolta definita normalizzazione dello spettro.
Rapporto A260/A280
Le proteine hanno un assorbimento maggiore a 280 nm rispetto a 260 nm. Il rapporto tra le assorbanze a 260 (A260) e 280 nm (A280) è ampiamente accettato come mezzo per valutare la contaminazione proteica in un campione di DNA purificato. Il rapporto A260 / A280 di un campione contenente DNA puro senza contaminazione da proteine deve essere compreso tra 1,8 e 2,0, con valori inferiori a 1,8 che indicano contaminazione da proteine e rapporti superiori a 2,0 che indicano contaminazione da RNA. Un basso rapporto A260 / A280 può anche essere indicativo della presenza di fenolo, un additivo utilizzato in alcuni metodi di purificazione del DNA.
La sensibilità del rapporto A260 / A280 per la rilevazione della contaminazione proteica è molto bassa: un rapporto di 1,75 - cioè solo 0,05 sotto 1,80 - potrebbe già indicare un contenuto proteico di circa il 50% nel campione. In questo esempio, la nostra concentrazione di DNA sarebbe in realtà solo la metà della concentrazione calcolata da A260. Sebbene alcuni sistemi offrano una concentrazione di DNA corretta in base alla deviazione dello spettro del campione dallo spettro teorico del DNA puro, le elevate quantità di proteine necessarie affinché la differenza sia misurabile rendono questa correzione inaffidabile.
Rapporto A260/A230
Le proteine non sono l'unico contaminante possibile nei campioni di DNA purificato. Alcuni contaminanti comuni causano un aumento relativo dell'assorbanza a 230 nm rispetto a 260 nm e il rapporto A260 / A230 viene quindi utilizzato anche per valutare la purezza del DNA. Il rapporto A260 / A230 del DNA puro è 1,8. Un rapporto inferiore indica la contaminazione da fenolo, EDTA, tiocianato di guanidina, Triton X-100 o carboidrati. Anche la contaminazione da proteine aumenta questo rapporto, ma il rapporto A260 / A280 è normalmente preferito come indicatore di contaminazione da proteine, poiché non è influenzato da una così ampia gamma di possibili contaminanti.
Limitazioni della spettrofotometria UV per valutare la purezza del DNA
Il limite di rilevamento della spettrofotometria UV è tipicamente di 2 ng / µl di DNA. Ciò significa che non è possibile valutare la purezza dei campioni di DNA al di sotto di questa concentrazione utilizzando questo metodo. Anche a concentrazioni vicine al limite di rilevamento, entrambi i rapporti A260 / A280 e A260 / A230 sono troppo imprecisi per valutare la purezza del DNA. Ciò è dovuto al fatto che i valori misurati sono molto vicini al limite di rilevamento dello strumento, dove la variabilità della misura rispetto ai valori misurati è enorme, ei valori A280 e A230 sono addirittura inferiori a quelli di A260, e quindi più vicino al limite di rilevamento dello strumento. Ad esempio, l'A260 di un campione con 2 ng / µL di DNA puro sarebbe 0,04 e quindi il suo A280 teorico sarebbe 0,02. Ma un'oscillazione di appena 0,01 farebbe passare i rapporti da 4,0 (con un'oscillazione di -0,01 per un valore misurato di 0,01) a 1,33 (con un'oscillazione di +0,01 per una lettura di 0,03). Pertanto, non è raro che i rapporti diano valori anche negativi a causa di A280 o A230 che scendono al di sotto di 0.
PUREZZA DEL DNA UTILIZZANDO COLORANTI FLUORESCENTI
Poiché i coloranti fluorescenti sono disponibili per specifiche specie di acido nucleico (ad esempio, dsDNA), la contaminazione da proteine o altre specie di acido nucleico ha un impatto minimo sulla quantificazione del DNA utilizzando questo metodo. Pertanto, se la purezza del DNA nel campione non è molto buona, le concentrazioni di DNA riportate da A260 potrebbero essere superiori a quelle riportate quando si utilizzano coloranti fluorescenti. Tuttavia, la quantificazione del DNA utilizzando coloranti fluorescenti non fornisce una stima diretta della presenza di contaminanti (che può essere importante, ad esempio, per valutare i possibili effetti sui metodi a valle). Se è necessario quantificare la presenza di proteine contaminanti o RNA (ad esempio, per ottimizzare il processo di purificazione), è necessario prelevare più aliquote del campione e ogni macromolecola deve essere quantificata separatamente.
INTEGRITÀ DELL'ACIDO NUCLEICO
Infine, qualche parola sulla valutazione dell'integrità degli acidi nucleici e, in particolare, dell'RNA. Sebbene lo spettro del campione sia molto informativo sulla purezza degli acidi nucleici estratti (se lo spettro differisce notevolmente da quello degli acidi nucleici puri e quindi indica una bassa purezza), non fornisce alcuna informazione sulla sua integrità. Ciò è dovuto al fatto che lo spettro di assorbimento dei nucleotidi liberi è identico a quello dei nucleotidi appartenenti a una grande molecola di DNA o RNA.
Per valutare l'integrità dell'RNA, il modo migliore è ancora eseguire un'elettroforesi su gel e visualizzare il DNA utilizzando un colorante intercalante. La presenza di strisci di peso molecolare inferiore è indicativa della degradazione dell'RNA. Le intensità relative degli rRNA 28S e 18S possono essere utilizzate per calcolare l'integrità dell'RNA, con un rapporto 2: 1 indicativo per RNA intatto.