Classificazione dei metodi in vivo utilizzati per studiare le interazioni proteina-proteina

Esistono molti modi per classificare i metodi in vivo utilizzati per studiare le interazioni proteina-proteina. Se il focus è in particolare sulla rilevazione e quantificazione dell'interazione, può essere classificata utilizzando le proprietà del sistema reporter utilizzato dai rispettivi metodi.

Tutti i metodi qui presentati si basano su un sistema reporter costituito da due parti: una parte è collegata a una delle proteine di interesse (a volte chiamata proteina "esca") e l'altra all'altra proteina di interesse (a volte chiamata " preda ”). Quando entrambe le proteine interagiscono tra loro, le due parti del sistema reporter vengono portate in stretta vicinanza e hanno un effetto chiaramente rilevabile. I termini "esca" e "preda" sono normalmente usati se c'è una proteina di interesse e l'obiettivo è quello di "cacciare" per i partner che interagiscono. Tuttavia, in molti casi entrambi i partner sono già noti e l'obiettivo è studiare l'interazione in modo più dettagliato (ad esempio, la sua regolazione).

I metodi menzionati di seguito sono discussi in maggiore dettaglio in Xing et al. 2016.

Metodi in base alla funzionalità del sistema reporter

Una differenza importante è se le due parti del sistema reporter sono completamente funzionali da sole o meno.

 

Assays di complementazione dei frammenti proteici (PCA)

Nel frammento proteico Complementation Assays (PCA), il reporter è una singola proteina che è stata scissa in due frammenti. I frammenti di per sé non sono funzionali, ma la proteina può ricostituirsi quando entrambi i frammenti vengono portati in stretta vicinanza e ripristinano la sua funzionalità. Ad esempio, nel test di complementazione della luciferasi divisa, la molecola della luciferasi viene divisa in due frammenti, nessuno dei quali può produrre luce, ma se entrambi i frammenti sono abbastanza vicini, la luciferasi viene ricostituita e può produrre nuovamente luce. Esempi di metodi PCA sono il sistema di ubiquitina divisa e l’ assay di complementazione della luciferasi divisa.

Assays a due ibridi

Nei assays a due ibridi, ogni parte del sistema reporter è una proteina o un dominio proteico completamente funzionale, ma viene prodotto un effetto specifico e misurabile quando entrambe le parti sono sufficientemente vicine. Ad esempio, nei test con due ibridi di Yeast, sia il dominio di legame al DNA che è collegato a una delle proteine di interesse che il dominio di transattivazione che è collegato all'altra proteina sono stabili e funzionali in modo indipendente, ma il gene reporter è solo espresso se sono vicini l'uno all'altro. Allo stesso modo, entrambe le proteine fluorescenti utilizzate in un assay FRET sono fluorescenti, ma la proteina accettrice emette luce solo se c'è interazione tra le proteine di interesse.

Metodi in base al segnale rilevato

Un'altra importante classificazione è il tipo di segnale generato dal reporter e utilizzato per rilevare l'interazione. Ciò influisce sulla strumentazione richiesta per il rilevamento, sulle possibilità che fornisce per una quantificazione accurata e sull'idoneità per analisi ad alto throughput e simili.

Metodi basati sull'espressione genica

In questo tipo di metodo, se entrambe le proteine di interesse interagiscono, la combinazione del dominio di legame al DNA e del dominio di transattivazione guida l'espressione del reporter. I reporter sono normalmente di due tipi possibili: marcatori prototrofici, come HIS3 o ADE2, che consentono la sopravvivenza su terreno di crescita impoverito, o enzimi cromogenici come la ß-galattosidasi, che possono essere utilizzati per la selezione tramite colorazione blu / bianca delle colonie. Sia il test per due ibridi di Yeast che il sistema split-ubiquitin (vedi sotto) si basano sull'espressione genica.

Questo tipo di reporter non è in grado di seguire i cambiamenti dinamici nell'interazione e può essere quantificato solo mediante assorbimento e utilizzando un enzima cromogenica. Tuttavia, tali reporter possono essere utilizzati per valutare un gran numero di interazioni binarie mescolando due tipi di accoppiamento aploidi che sono stati trasformati con diversi set di proteine di interesse. Quindi, sono molto utili per lo screening su larga scala delle interazioni proteina-proteina.

Nella versione classica di questo metodo il dominio di legame al DNA N-terminale dell'attivatore trascrizionale GAL4 è legato a una proteina di interesse e il dominio di transattivazione C-terminale all'altra. Quando entrambe le proteine interagiscono, la loro associazione produce un fattore di trascrizione chimerico, che attiva l'espressione genica a valle della sequenza di attivazione a monte GAL1 (Fields and Song 1989). Ulteriori sonde separate sono state stabilite con successo. Il test dell'due-ibrido del lievito è facile da eseguire, ma può essere utilizzato solo per studiare le interazioni tra proteine con localizzazione nucleare.

Questo sistema è simile nel concetto al sistema dell'due-ibrido del lievito ed è altrettanto facile da implementare. Tuttavia, ha l'ulteriore vantaggio che può essere applicato praticamente a qualsiasi proteina, non solo alle proteine nucleari. Come spiegato sopra, il sistema split-ubiquitin è una specie di PCA: la proteina ubiquitina è divisa in due frammenti non funzionali, ognuno dei quali è fuso con un membro della coppia di proteine di interesse. Quando i due frammenti interagiscono, l'ubiquitina si riassembla e diventa funzionale. Questo promuove la scissione tramite la proteasi ubiquitina-specifica. Nella versione classica, questa scissione porta al rilascio di un fattore di trascrizione, che poi attiva l'espressione del gene reporter.