Ritmi circadiani
Gli orologi biologici endogeni determinano ritmi giornalieri che consentono agli organismi di anticipare i cambiamenti ambientali e di coordinare e adattare la loro fisiologia in modo sincronizzato. L'orologio circadiano consente alle piante di anticipare e rispondere alle variazioni ambientali, migliorando così la loro fitness. I segnali ambientali e metabolici alimentano l'orologio, che è costituito da una rete di geni, e lo mantengono sincronizzato con i cicli giorno/notte. In cambio, l'orologio controlla varie vie e si assicura che vengano attivate al momento giusto della giornata. La luce è uno dei cosiddetti Zeitgeber, che può resettare l'orologio.
IMAGING IN VIVO NELLA RICERCA SUL RITMO CIRCADIANO
La ricerca sui ritmi circadiani trae vantaggio dal monitoraggio in tempo reale di linee reporter in cui il promotore di un gene di interesse guida l'espressione della luciferasi pGENE::LUC+ in combinazione con sistemi di imaging sensibili. Il monitoraggio dell'espressione della luciferasi della lucciola mediante un sistema di imaging in vivo consente di segnalare in modo non invasivo e in tempo reale l'espressione genica regolata. Questa tecnica è ampiamente applicabile all'analisi della regolazione trascrizionale, post-trascrizionale o traslazionale. Inoltre, l'instabilità dell'attività della luciferasi consente al marcatore bioluminescente di ricapitolare sia gli aumenti che le diminuzioni dell'espressione in un arco di tempo di diverse ore. In questo modo, è possibile studiare la concentrazione tissutale dell'orologio circadiano e le sue caratteristiche, o selezionare mutanti difettosi nella regolazione spaziale dell'espressione dei geni di interesse.
Il NightShade
Il sistema di imaging in vivo NightShade utilizza una telecamera CCD a basso rumore ed elevata sensibilità ed è adatto sia alla luminescenza che alla fluorescenza. NightShade è stato progettato specificamente per l'imaging delle piante e presenta numerosi vantaggi rispetto alle telecamere generiche o ai sistemi di imaging progettati per la ricerca sugli animali:
- Simulazione della luce diurna con qualità e intensità della luce flessibili.
- Software intuitivo con un potente programmatore, che consente di programmare l'intensità e la qualità della luce desiderata per diversi giorni e di acquisire le immagini nei punti temporali desiderati.
- Porte a tenuta di luce per l'inserimento di tubi per l'irrigazione (fondamentale per l'acquisizione di immagini durante diversi giorni) e per altri scopi.
- Dimensioni flessibili del campione: dalle piantine che crescono in capsule di Petri alle piante in vaso.
- Posizione di montaggio della telecamera laterale per l'acquisizione di immagini di piante intere, dalle foglie alle radici.
- Vassoio anticondensa con controllo della temperatura per immagini di alta qualità quando si lavora con le piastre di Petri.
NOTA APPLICATIVA
Negli organismi multicellulari, gli orologi circadiani sono naturalmente variabili a livello individuale, tissutale e cellulare, il che si traduce in dati rumorosi o imprecisi. Pertanto, è necessaria una certa robustezza per affrontare con precisione le questioni chiave della biologia circadiana. Questa nota applicativa presenta un semplice protocollo per gli esperimenti sui ritmi circadiani con linee reporter di Arabidopsis thaliana utilizzando NightShade, che migliora la qualità dei dati, riduce la variazione di luminescenza tra le repliche e ha un'elevata correlazione con le previsioni dei modelli.