QU'EST-CE QUE LA LUMINESCENCE ? DÉFINITION DE LA LUMINESCENCE
Le terme "luminescence" désigne l'émission de lumière qui n'est pas due à une température élevée. Le phénomène est donc également connu sous le nom de "lumière froide".
Il existe de nombreux processus d'émission de lumière tout autour de nous. Ils sont soit naturels, soit produits artificiellement. Les lucioles et le phytoplancton (bioluminescence) sont des exemples de luminescence naturelle. Les diodes électroluminescentes (DEL) et les écrans d'ordinateur (électroluminescence) sont des exemples de luminescence artificielle.
LES TYPES DE LUMINESCENCE
Les sciences de la vie utilisent différents types de luminescence. Les différents types de luminescence peuvent être regroupés selon deux critères différents : la méthode d'excitation de la substance et la durée d'émission du signal.
A. Types de luminescence par méthode de génération de substance à haute énergie :
La plupart des types de luminescence impliquent une substance à haute énergie qui perd de l'énergie sous forme de lumière. Le mécanisme par lequel cette substance est générée ou obtient l'énergie "supplémentaire" à libérer sous forme de lumière est un moyen utile de classer la luminescence.
1. Chimiluminescence
La chimiluminescence décrit l'émission de lumière à la suite d'une réaction chimique. L'enthalpie de réaction fournit l'énergie nécessaire, produisant un produit ou intermédiaire excité. Lorsque l'intermédiaire tombe dans son état fondamental, il émet un photon.
1.1 Bioluminescence
Si une telle réaction se produit dans un organisme vivant, par ex. chez les lucioles, c'est ce qu'on appelle la bioluminescence. Cette réaction biochimique implique une molécule électroluminescente appelée luciférine et une enzyme appelée luciférase. Les luciférases sont une famille de photoprotéines que l'on retrouve chez divers insectes, organismes marins et procaryotes [1]. Ces enzymes catalysent l’oxydation de la luciférine, entraînant une émission de photons. Selon l'organisme, l'enzyme et le substrat produits ainsi que les cofacteurs nécessaires sont différents. En conséquence, la longueur d’onde d’émission de la lumière produite varie, produisant des spectres d’émission compris entre 400 nm et 620 nm.
L’une des luciférases les plus couramment utilisées dans les sciences de la vie est la luciférase de luciole qui émet une lumière jaune-verte à environ 550 – 570 nm. Un autre bon exemple est la Renilla Luciferase de la pensée marine Renilla reniformis, émettant de la lumière bleue à 480 – 500 nm.
2. Photoluminescence
La photoluminescence décrit la luminescence d'une substance excitée (c'est-à-dire portée à un niveau d'énergie plus élevé) par la lumière, généralement ultraviolette ou visible. C'est ce qu'on appelle la photoexcitation et est le résultat du déplacement d'électrons vers des niveaux énergétiquement plus élevés grâce à l'absorption de photons. Comme En raison de l'excitation, divers processus de relaxation se produisent généralement dans lesquels des photons d'énergie généralement inférieure sont réémis. La fluorescence et la phosphorescence sont les principaux types de photoluminescence, et une molécule ayant des propriétés fluorescentes est appelée un fluorophore. Dans les sciences de la vie, cette forme de La luminescence est la plus couramment utilisée dans les tests de fluorescence
BRET et FRET impliquent un type particulier de transfert d'énergie qui pourrait être considéré comme une forme de photoluminescence. Dans les deux méthodes, il existe deux molécules ou groupes, un donneur et un accepteur, le donneur étant soit une luciférase (en BRET), soit un fluorophore (en FRET), et l'accepteur étant un fluorophore pouvant être excité à la longueur d'onde d'émission du donneur. L'excitation de l'accepteur par le donneur rappelle la fluorescence, cependant, dans le BRET et le FRET, l'énergie excédentaire est transportée vers l'accepteur par un processus non radiatif sous la forme du photon virtuel émis — ce transfert est facilité par le dipôle. -couplages dipolaires entre les molécules et est appelé résonance. Le terme virtuel indique le fait que le photon est réabsorbé avant que ses propriétés, telles que la longueur d'onde, ne prennent une signification physique [3].
3. Électroluminescence
L'électroluminescence décrit la génération de lumière résultant d'un courant électrique traversant une substance. Dans les sciences de la vie, elle est généralement utilisée dans certaines formes d'immunoessais et en immunochimie pour des applications cliniques.
Le test immunoélectrochimiluminescent (ECLIA) [2] est une méthode très sensible dans laquelle un intermédiaire électrochimique est généré à partir de précurseurs stables (c'est-à-dire le marqueur actif ECL) à la surface d'une électrode. La molécule émet de la lumière lorsqu’elle est détendue à un niveau d’énergie inférieur.
4. Radioluminescence
La radioluminescence se produit lorsque des substances spécifiques sont touchées par des rayonnements ionisants tels que les rayons α, β ou γ. Dans un passé récent (années 1960), ce phénomène était utilisé pour faire briller les cadrans de montres dans l'obscurité.
Ce principe est appliqué pour la séparation et la détection de traceurs radioactifs par chromatographie liquide haute performance (radio HPLC) dans diverses applications pharmaceutiques et cliniques. En radio HPLC, un électron frappe une molécule scintillatrice et l’élève à un niveau d’énergie plus élevé. Le scintillateur revient immédiatement à son niveau d’énergie initial en émettant des photons. Ces photons sont détectés par un tube photomultiplicateur (PMT).
Dans le domaine des sciences de la vie, le terme « luminesce » est le plus souvent utilisé pour désigner la chimiluminescence (et, par extension, la bioluminescence) par opposition à la fluorescence. Mais comme vous l’avez vu ci-dessus, la fluorescence est un sous-type de luminescence. Apprenez-en davantage sur les différences entre la luminescence, la fluorescence et la phosphorescence.Comme c'est la convention habituelle dans le domaine, dans la suite de l'article nous allons utiliser le terme luminescence pour désigner la chimiluminescence et la bioluminescence, sauf indication contraire.
B. Types de luminescence par durée d'émission du signal
1. Luminescence flash
Les tests qui produisent un signal court mais généralement fort sont appelés tests flash. La demi-vie du signal de ces tests est généralement de l'ordre de quelques minutes, voire plus courte. Le défi avec les tests flash est qu'une fois que vous ajoutez le réactif de test, le signal culmine presque immédiatement, puis diminue rapidement. Cela ne pose pas de problème lors de l'utilisation d'un luminomètre à tube unique, car chaque échantillon peut être mesuré individuellement immédiatement après l'ajout du réactif de démarrage. Mais qu'en est-il de la mesure dans un luminomètre à microplaque?
Si l’on démarrait la réaction dans tous les puits simultanément dans une plaque à 96 puits, puis que l’on mesurait séquentiellement, seuls les premiers puits seraient mesurés au pic de l’intensité du signal. Cependant, dans les puits mesurés ultérieurement, l’intensité du signal de luminescence serait déjà considérablement réduite.
Par conséquent, la mesure des tests flash dans un lecteur de microplaques nécessite l’utilisation de ce que l’on appelle des injecteurs. De cette façon, le réactif de démarrage peut être ajouté en premier dans chaque puits et le signal mesuré immédiatement. Le test Dual-Luciferase Reporter™ et les tests SPARCL sont tous deux des exemples de tests de type flash.
2. Luminescence brillante ("glow")
Les tests de type lueur, en revanche, ont une intensité de signal qui dure des heures. Bien que l’intensité de leur signal soit réduite, le flux de travail beaucoup plus simple en raison de l’intensité du signal plus longue, qui ne nécessite pas d’injecteurs de réactifs, fait souvent de cette forme de test par luminescence la méthode de choix. Cependant, comme tous les puits émettent de la lumière en même temps, il est possible que la lumière provenant de puits adjacents interfère dans la mesure, dans un phénomène appelé diaphonie (voir ci-dessous).