Qu'est-ce que le crosstalk?
Dans le domaine des mesures sur microplaques, la diaphonie consiste à savoir si un signal produit dans un puits d'une microplaque est maintenu dans ce puits sans interférer avec les signaux des puits adjacents. Cela peut entraîner des signaux faussement élevés et pose un problème majeur lors de l'analyse d'échantillons à faible signal lorsque ceux-cisont adjacents à des échantillons à signal élevé. La plus simple des solutions est d'essayer de séparer les échantillons à signal élevé des autres pour éviter autant que possible le crosstalk, mais cela représente une perte de puits, option non envisageable lorsque votre débit est élevé. Alors, que devez-vous envisager afin de minimiser la diaphonie dans votre test ?
Influence du test sur le crosstalk
En général, il est important de considérer la puissance du signal de votre test. Les tests de chimioluminescence? par exemple, peuvent générer des signaux relativement élevés, entraînant une importante crosstalk. Mais il est important également de prendre en compte la longueur d'onde de la lumière émise. Plus la longueur d'onde de l'émission est courte, plus son niveau d'énergie est élevé, ce qui rendra votre test plus sujet à le crosstalk.
D'un autre côté, les tests de fluorescence sont moins sujets au crosstalk, car généralement seul le puits mesuré est éclairé par la lumière d'excitation et la durée de vie de la fluorescence est très courte (de l'ordre de quelques nanosecondes pour les tests de fluorescence rapides).
Deux autres facteurs importants influent sur la diaphonie : d'une part, la microplaque utilisée peut avoir un impact significatif sur le niveau de crosstalk que vous observerez ; d'autre part, plusieurs considérations liées à la conception de l'instrument influeront sur son niveau.
Influence des microplaques sur le crosstalk
Les microplaques utilisées pour le développement d'essais et le criblage à haut débit sont généralement fabriquées à partir d'un polymère de polystyrène. Pour les plaques blanches, on ajoute un azurant optique, le dioxyde de titane. Cela permet d'augmenter la réflectivité avec une surface brillante très lisse à l'intérieur des puits. Vous trouverez, ci-dessous, les considérations générales relatives à la conception des plaques qui auront un impact sur le niveau de diaphonie que vous observerez:
Plastique et couleur de la microplaque
- Les microplaques noires présentent la plus faible quantité de crosstalk, suivies par les microplaques gris clair
- Le potentiel de crosstalk des microplaques blanches varie en fonction du niveau de dioxyde de titane utilisé, mais reste généralement moyen
- Les microplaques transparentes donnent le plus grande crosstalk, car la lumière peut traverser librement les parois, et ne doivent jamais être utilisées pour un test de luminescence
Conception des microplaques
La géométrie du puits, la distance d'un puits à l'autre ainsi que l'épaisseur de la paroi des puits adjacents et du fond du puits ont une influence sur le niveau de crosstalk que l'on observera.
Berthold Technologies fournit les microplaques les mieux adaptées aux mesures de luminescence, de fluorescence et d'absorbance.
Influence de l'instrument sur le crosstalk
Les lecteurs de microplaques à haute performance sont généralement dotés de technologies qui réduisent le crosstalk à des niveaux négligeables. En général, l'alignement des différents composants du chemin optique a été optimisé pour éviter que le signal provenant de puits adjacents ne soit mesuré dans le puits analysé. En outre, des dispositifs de masquage physique ont été appliqués pour isoler le puits mesuré des puits adjacents.
Chez Berthold Technologies, nous avons breveté des conceptions permettant d'éliminer les signaux des puits non mesurés qui sont positionnés automatiquement en fonction du format de plaque choisi. Cette caractéristique est présente dans tous nos lecteurs de microplaques. La spécification de crosstalk pour la plupart de nos lecteurs de plaques est de 10-6. Cela équivaut à 1 000 000 de comptages dans un puits particulier et à un seul comptage dans tous les puits adjacents. Pour les lecteurs de plaques d'autres fabricants, nous avons constaté que les valeurs varient de 100 à plus de 5 000 dans les puits adjacents. Comme vous pouvez le constater, la conception intelligente des instruments peut réduire efficacement le crosstalk physique entre les puits adjacents, de sorte qu'il n'y a pratiquement pas de crosstalk d'échantillon à échantillon.