Les lectures par le haut sont généralement plus sensibles
La lecture supérieure fournit généralement de meilleurs rapports signal/bruit pour les analyses basées sur des solutions telles que la quantification de l'ADN ou des protéines. En général, la lecture de la fluorescence par le haut est plus sensible que la lecture par le bas. Ceci est une conséquence de l'atténuation et de la diffusion de la lumière par les plastiques du fond ondulé, qui peuvent augmenter le fond et réduire l'efficacité de la mesure. Par conséquent, la qualité et l'épaisseur de la base en plastique transparent et le type de fluorophore sont des facteurs importants dans la conception de votre test.
Le type de microplaque est essentiel pour la lecture par le dessous
Un autre facteur à prendre en compte est bien sûr le type de plaque à fond transparent que vous utiliserez - utilisez-vous une plaque de culture tissulaire à paroi opaque ? La plaque est-elle blanche ou noire ? Et le fond transparent est-il en polystyrène ou en verre?
La réponse, aux questions ci-dessus, est étroitement liée à la longueur d'onde de la lumière souhaitée. Si vous essayez de détecter la lumière visible (350-900 nm), un fond en plastique suffit généralement. Cependant, pour des détections inférieures à 350 nm, un fond en matériau transparent aux UV, par exemple du quartz ou des polymères COP/COC modernes, est nécessaire. En dernier recours, les plaques de fond en verre optique, plus coûteuses, peuvent être utilisées permettant une détection à la fois par le haut et par le bas, ainsi qu'une observation microscopique des cellules à faible bruit de fond.
La principale différence entre les plaques blanches et noires réside dans leurs propriétés réfléchissantes. Les plaques blanches réfléchissent la lumière et maximisent le signal de sortie de la lumière. Les panneaux noirs, quant à eux, absorbent la lumière et réduisent le bruit de fond et le crosstalk. Ainsi, les plaques blanches sont couramment utilisées pour les essais luminescents tandis que les plaques noires sont utilisées pour les tests fluorescents.
Quand la lecture par le dessous donne-t-elle de meilleurs résultats?
- Lorsque vous travaillez avec des cellules adhérentes qui se développent au fond de la plaque et qui expriment, se lient ou sécrètent un fluorophore uniquement au niveau ou à proximité de leur point d'adhésion.
- Les tests de chimiotaxie pour surveiller la migration cellulaire à travers une membrane. L'analyse se fait généralement par une combinaison de lectures par le haut et par le bas.
- Certains tests, à base de cellules (par exemple GeneBLAzer® ou QBT™ Fatty Acid Uptake) ne peuvent pas être lus par le haut car les propriétés optiques des tampons utilisés dans le test altèrent l'excitation ou l'émission du fluorophore.
Si vous avez encore des doutes sur la technologie de lecture à utiliser, vous pouvez commencer par utiliser un protocole de lecture en haut et en bas et comparer les résultats pour faire votre choix.
GeneBLAzer® est une marque déposée de Invitrogen Corporation.
QBT™ Fatty Acid Uptake est une marque déposée de Molecular Devices.