Un gène se compose de deux éléments fonctionnels principaux: d'une part, une séquence d'ADN dite codante qui fournit des informations sur la protéine produite. D'autre part, une séquence promotrice spécifique qui est liée à la région codante et régule la transcription du gène. Le promoteur sert à activer ou supprimer l'expression du gène selon les besoins.
Le but principal du test du gène rapporteur est d'étudier le promoteur d'un gène d'intérêt, i. la régulation de son expression. Cela peut être fait en liant le promoteur d'intérêt à un gène facilement détectable, tel que le gène de la luciférase de luciole, qui catalyse une réaction qui produit de la lumière.
Habituellement, les cellules sont ensuite exposées à divers facteurs ou conditions, ou des modifications peuvent être apportées dans l'ordre du rapporteur, dont l'effet peut facilement être suivi en mesurant les changements d'émission de lumière.
EXEMPLES DE GÈNES RAPPORTEURS
Les gènes rapporteurs communs sont la β-galactosidase, la β-glucuronidase et la luciférase. Diverses méthodes de détection (voir ci-dessous) sont utilisées pour mesurer la protéine du gène rapporteur exprimée. Celles-ci incluent la luminescence, l'absorption et la fluorescence.
Les dosages basés sur la luminescence sont très courants pour plusieurs raisons:
- ils ont une sensibilité élevée (entre 10 et 10000 fois plus élevée que celle des méthodes basées sur l'absorption ou la fluorescence, selon le test spécifique et le rapporteur utilisé)
- la plupart des types de cellules n'ont pas d'activité luciférase endogène
- Les dosages de luminescence ont une large plage de mesure dynamique
- ils peuvent être mis en œuvre rapidement
- le coût est relativement faible
Les dosages des rapporteurs luminescents sont mesurés avec un luminomètre.
Gènes rapporteurs par méthode de détection
| Rapporteur | Luminescence | Fluorescence | Absorbance |
|---|---|---|---|
| Luciferase | |||
| β-Galactosidase (β-Gal) | |||
| β-Glucuronidase (β-GUS) | |||
| Phosphatase alcaline sécrétée (SEAP) | |||
| Protéine fluorescente verte (GFP) | |||
Luciférase de la luciole
Le gène rapporteur le plus polyvalent et le plus courant est la luciférase de la luciole nord-américaine Photinus pyralis. La protéine ne nécessite aucune modification post-traductionnelle de l'activité enzymatique. Elle n'est même pas toxique in vivo à des concentrations élevées et peut être utilisée dans les cellules procaryotes et eucaryotes. La luciférase de la luciole catalyse l'oxydation bioluminescente de la luciférine en présence d'ATP, de magnésium et d'oxygène.
Dual-Luciferase® Reporter Gene Assay
Le système de test Dual-Luciferase® Reporter (DLR) contient deux enzymes rapporteurs de luciférase différentes qui sont exprimées simultanément dans chaque cellule. La luciférase de luciole et la luciférase de Renilla peuvent distinguer leurs substrats bioluminescents respectifs et ne s'activent pas mutuellement. La luciférase de luciole est contrôlée par le promoteur d'intérêt et la luciférase de Renilla par un promoteur qui fournit une expression stable; De cette manière, l'expression de la luciférase de Renilla peut être utilisée comme contrôle interne pour compenser les changements du nombre de cellules, l'efficacité de la transfection et d'autres erreurs. Bien que cela soit très pratique, il faut veiller à ce qu'aucune des conditions examinées ne modifie l'expression de la luciférase de Renilla, car cela pourrait conduire à des conclusions erronées.
Nouvelles luciférases
Ces dernières années, d'autres luciférases ont été utilisées pour des dosages de gènes rapporteurs tels que les luciférases Gaussia, Cypridina ou NanoLuc®. Ces luciférases dites «nouvelles» sont jusqu'à 1000 fois plus brillantes que les luciférases de luciole ou de Renilla et présentent généralement d'autres avantages, par ex. stabilité améliorée, taille plus petite, sécrétion extracellulaire, etc.
Notes d'application relatives aux gènes rapporteurs
DLR Assay (Promega) with the Orion II Dual Luciferase Reporter Assay (Promega) with the Orion II Microplate Luminometer
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Monitoring of Renilla Luciferase Activities in-vitro and in-vivo The expression of a novel EnduRen™ and ViviRen™ Renilla luciferase reporter gene (Promega) in vitro and in vivo is explored
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Bioluminescence Imaging using NightOWL Bioluminescence Imaging using NightOWL LB 981 NC 100. Cells expressing luciferase gene under the control of a constitutive promoter were used as a model of in vivo proliferation of cancer cells.
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Luciferin bioavailability in mice during in-vivo imaging To determine the optimal luciferase activity detection time, time course experiments were performed.
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Circadian Clock with NightSHADE Getting to Know The Circadian Clock and Plant Growth With NightSHADE
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Analysis of circadian rhythms using NightShade Improved experimental setup for analysis of circadian rhythms using the NightShade Plant In Vivo Imaging System
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DLR™ VALIDATION OF THE TRISTAR 3 Validation of the Tristar 3 with the Dual-Luciferase® Reporter System from Promega.
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DLR™ VALIDATION OF THE TRISTAR 5 Validation of the Tristar 5 for the Dual-Luciferase® Reporter System from Promega.
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DLR™ VALIDATION OF THE CENTRO LB 963 Validation of the Centro LB 963 for the Dual-Luciferase® Reporter System from Promega.
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Instruments recommandés pour les tests de gènes rapporteurs
Dual-Luciferase et NanoLuc sont des marques déposées de Promega Corp.