L'IMPORTANCE DE LA MESURE DU CALCIUM INTRACELLULAIRE
Le calcium bivalent est un messager intracellulaire dans de nombreuses voies de transduction des signaux eucaryotes. La plupart des systèmes de signalisation du calcium ont une chose en commun : ils génèrent decourtes impulsions calciques, régulant ainsi les fonctions cellulaires.
Les niveaux de calcium intracellulaire sont généralement maintenus à un faible niveau, car le calcium forme souvent des complexes insolubles avec des composés phosphorylés et carboxylés. En général, les concentrations de calcium cytosolique sont de 100 nM. En réponse aux stimulis, le calcium est libéré soit du milieu externe, soit des réserves internes pour augmenter la concentration en calcium.
LA MESURE DU CALCIUM INTRACELLULAIRE PAR LUMINESCENCE
La surveillance des changements des niveaux de calcium intracellulaire à l'aide de l'aequorine dans une réaction luminescente de type flash est très efficace. Dans les deux cas, l'activation des récepteurs couplés aux protéines G (également appelés GPCR ou récepteurs 7TM) induisant la dégradation des phospholipides de l'inositol et l'activité des canaux ioniques calciques voltageés - ces derniers provoquant un afflux assez lent - peuvent facilement être réalisés à l'aide des injecteurs de réactifs du luminomètreCentro et des lecteurs de microplaquesTristar.
LA MESURE DU CALCIUM INTRACELLULAIRE PAR FLUORESCENCE
De plus, la concentration de calcium libre dans les cellules intactes peut être surveillée en utilisant des chélateurs polycycliques tels que Fura-2 ou Indo-1. Fura-2 et Indo-1 fournissent une lecture ratiométrique, réduisant les effets des colorants qui fuient ou blanchissent ou par des conditions d'essai variables.
Les propriétés de fluorescence des deux colorants changent considérablement lorsque le calcium est lié, ce qui permet la détection directe des flux de calcium en réponse à des voies de transduction de signaux spécifiques. Le maximum d'émission de l'Indo-1 passe de ~475 nm en milieu sans calcium à ~400 nm lorsque le colorant est saturé de calcium. Avec Fura-2, le maximum d'absorption de Fura-2 passe de 380 nm à 340 nm lors de la liaison du calcium, tandis que l'émission reste constante à 510 nm. Cela conduit à un changement inverse de l'intensité de la fluorescence : une augmentation à 340 nm et une diminution à 380 nm.
Le changement de filtre dans nos lecteurs de microplaques multimodes est extrêmement rapide (~150 ms), et permet une haute résolution de détection si des changements rapides de la concentration en calcium doivent être surveillés. La cinétique de réaction rapide peut être surveillée avec au moins un injecteur en position de lecture.
L'agent fluorescent Fluo-4 peut également être utilisé pour surveiller les changements de calcium intracellulaire, et présente l'avantage d'utiliser une seule mesure, de sorte qu'aucun changement de filtre n'est nécessaire. Cela est utile si les changements des niveaux de calcium intracellulaire sont trop rapides pour l'instrument utilisé (par exemple, s'il utilise un monochromateur ou s'il a un changement de filtre lent). Cependant, il n'est pas ratiométrique, et donc plus sujet aux différentes conditions de test, aux fuites et au blanchiment.
NOTES D'APPLICATION RELATIVES AU CALCIUM INTRACELLULAIRE
Calcium monitoring with the Mithras Calcium monitoring using Fura-2 with the Mithras LB 940 multimode plate reader
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Intracellular Ca2+ with Clonetics™ Primary Sensors and the Orion II Monitoring Intracellular Ca2+ Fluxes with Clonetics™ Primary Sensors using the Orion II Microplate Luminometer
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Screening of GPCR antagonists using Ca2+ measurements and the TriStar² S 3 commercially available compounds are screened for P2Y2 receptor inhibition using the calcium mobilisation assay with two different fluorescent dyes measured on a TriStar² LB 942 multimode microplate reader.
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INSTRUMENTS RECOMMANDÉS POUR LES MESURES DU CALCIUM INTRACELLULAIRE
Comme mentionné ci-dessus, les injecteurs en position de mesure sont recommandés pour les mesures intracellulaires utilisant la luminescence, et les filtres à commutation rapide pour les mesures utilisant la fluorescence. Tous les lecteurs de microplaques ci-dessous répondent à ces recommandations.
Les luminomètres à tube équipés d'injecteurs peuvent également être utilisés pour les mesures intracellulaires du calcium par luminescence, et conviennent également pour un faible débit d'échantillons. Dans les luminomètres à tube, les injecteurs sont toujours en position de mesure.