PRINCIPE BRET
BRET est basé sur le fait que l'énergie obtenue, à partir d'une réaction de la luciférase, peut être utilisée pour exciter une protéine fluorescente lorsqu'elle est à proximité immédiate de l'enzyme luciférase. La technologie implique la fusion du donneur (luciférase) et de la molécule acceptrice (fluorescentes) en protéines d'intérêt. La co-expression des constructions de fusion dans les cellules vivantes permet d'étudier quantitativement leur interaction en temps réel,ce qui conduit à une émission de fluorescence à une longueur d'onde caractéristique. L'énergie dégagée par l'accepteur par rapport à l'énergie émise par le donneur est appelée signal BRET ou rapport BRET. Elle dépend des propriétés spectrales, du rapport, de la distance et l'orientation relative des molécules donneur et accepteur et la force et la stabilité de l'interaction entre les protéines d'intérêt
BRET est très similaire à FRET, mais dans FRET, le donneur est également une protéine fluorescente qui doit être excitée. Etant donné que BRET n'a pas besoin d'une source de lumière externe pour exciter le donneur, son bruit de fond est très faible et ne souffre pas des problèmes souvent associés à FRET, tels que l'autofluorescence, la diffusion de la lumière ou le photoblanchiment. Les autres avantages de BRET sont qu'il s'agit d'une technologie homogène et non radioactive, et que le signal ratiométrique minimise les interférences dues aux conditions d'essai.
BRET methods
Au cours de ces dernières années, différentes méthodes BRET ont été développées. Elles ont toutes leurs limites et leurs avantages. Le tableau ci-dessous présente les différentes paires de donneurs et d'accepteurs et les longueurs d'onde correspondantes:
| Méthode | Donateur | Substrat | Emission des donneurs [nm] | Accepteur | Emission d'accepteur [nm] |
|---|---|---|---|---|---|
| BRET 1 | RLuc | Coelenterazine | 480 | eYFP | 530 |
| BRET 2 | RLuc | Coelenterazine 400a (Deep Blue C™) | 395 | GFP | 510 |
| eBRET 2 | RLuc8 | Coelenterazine 400a (Deep Blue C™) | 395 | GFP | 510 |
| BRET 3 | Firefly | Luciferin | 565 | DsRed | 583 |
| QD-BRET | RLuc/RLuc8 | Coelenterazine | 480 | QDot | 605 |
| NanoBRET | NanoLuc® | Furimazine | 460 | HaloTag® Ligand | 618 |
BRET 1
La méthode BRET originale utilisant la Coelentérazine comme substrat est aujourd'hui appelée BRET 1. Elle se caractérise par des signaux puissantss et une longue durée de vie.
BRET 2
Par rapport à BRET 1, il a une meilleure séparation des pics d'émission du donneur et de l'accepteur. Cela fait de BRET 2 un meilleur choix pour les tests de criblage où des rapports signal/bruit élevés sont nécessaires. Une limitation évidente de BRET 2 est sa faible émission de lumière et sa courte durée de vie.
BRET 2 amélioré (eBRET)
eBRET conduit à un signal environ 5 fois meilleur que dans la version originale de BRET 2. eBRET utilise un nouveau mutant de la luciférase de Renilla, Rluc8.
BRET 3
La luciférase de Firefly dans BRET 3 présente une autofluorescence cellulaire moindre à la longueur d'onde d'émission (565 nm), mais présente des inconvénients dus aux signaux faibles et aux chevauchements entre les pics d'émission du donneur et de l'accepteur.
QD-BRET
Une toute nouvelle version de BRET est le Quantum Dot-BRET (QD-BRET). Les pics d'émission sont clairement séparés, ce qui rend le QD-BRET idéal pour les applications de criblage. Les inconvénients sont la grande taille des molécules QD (1,5 - 6 nm) et le fait que les protéines QD ne peuvent être génétiquement codées. Les protéines QD ne peuvent pas être exprimées dans les cellules vivantes, elles doivent être ajoutées.
NanoBRET™
NanoBRET™ utilise une luciférase beaucoup plus brillante que les luciférases classiques, NanoLuc®, et présente une très bonne séparation entre l'émission du donneur (460 nm) et celle de l'accepteur (618 nm).
APPLICATIONS BRET
BRET peut être mesuré dans des lecteurs de microplaques pour étudier les interactions protéine-protéine, en particulier dans le domaine de la recherche sur les récepteurs couplés aux protéines G. La possibilité d'étudier les interactions dans les cellules de mammifères vivants évite de nombreux problèmes associés à des techniques telles que la co-immunoprécipitation et le criblage à deux hybrides de levure.De plus, la grande sensibilité de BRET permet d'étudier les protéines à des concentrations physiologiques, ce qui constitue un avantage significatif par rapport aux techniques qui nécessitent des niveaux élevés d'expression des protéines.
En particulier dans le domaine de la recherche sur les récepteurs couplés aux protéines G, la technologie BRET offre la possibilité d'établir un test homogène, universel et fonctionnel, en tirant parti du fait que le ß-arrestin (qui joue naturellement un rôle dans la désensibilisation des récepteurs) se lie à la partie intracellulaire du récepteur activé. Les récepteurs couplés aux protéines G, également appelés récepteurs 7TM (7-transmembrane), constituent la superfamille de protéines la plus vaste et la plus diversifiée qui soit. Dans une moindre mesure, seuls les ligands sont connus.
Pour avoir une idée de l'importance des RCPG dans la découverte de médicaments:
- Actuellement, environ 30 % des médicaments sont ciblés contre les RCPG
- Seuls 5 % des récepteurs connus sont visés par les médicaments
- Les ligands correspondants ne sont connus que pour 20% du reste
BRET publication compilation A compilation of scientific articles using Mithras or Tristar microplate readers for BRET.
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NanoBRET™ with the Mithras² Beschreibung
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NanoBRET™ with the TriStar² S Promega NanoBRET™ protein:protein interaction system with the TriStar² S Multimode Microplate Reader
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Comparison of filter sets for BRET1 using Mithras Comparison of filter sets for BRET1 assays: ß-arrestin2 (ßARR2) recruitment to the vasopressin V2 receptor using the Mithras LB 940 Multimode Microplate Reader
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Basic Considerations for BRET Assays with the Mithras Basic Considerations for Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) Assays for G-protein coupled receptor protein interactions in living cells
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BRET to monitor dynamic receptor-protein interactionswith the Mithras Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) as a means of monitoring dynamic receptor-protein interactions in living cells measured on LB 940 Mithras Multimode Microplate Reader
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BRET-based studies of receptor dynamics with Mithras Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-based studies of receptor dynamics in living cells with Berthold’s Mithras Multimode Microplate Reader
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BRET Assay for 7TM Receptors Using the Mithras A Functional BRET Assay for 7TM Receptors Using the Mithras LB 940 Multimode Plate Reader
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Microplate Readers recommended for BRET
Un lecteur de microplaques ou un luminomètre capable de mesurer la luminescence avec une grande sensibilité en utilisant des filtres est la meilleure combinaison pour BRET ; des lecteurs avec monochromateurs peuvent également être utilisés, mais avec une sensibilité réduite. Étant donné que deux mesures doivent être effectuées à des longueurs d'onde différentes, un lecteur avec au moins deux filtres d'émission est nécessaire (ce n'est pas possible, par exemple, pour les lecteurs avec un seul cube de filtre avec 1 filtre d'excitation + 1 filtre d'émission). Tous les lecteurs de microplaques ci-dessous sont recommandés pour BRET.