LES MÉTHODES BASÉES SUR L'ABSORBANCE
Spectrophotométrie UV utilisant l'absorbance à 260 nm
L'absorbance est la méthode de choix pour la quantification de routine de l'ADN et de l'ARN depuis des décennies. Elle est simple et pratique à utiliser car aucun autre traitement de l'échantillon (autre que l'extraction de l'ADN) ou réaction avec d'autres substances n'est nécessaire. Cependant, elle n'est pas très spécifique (elle mesure tous les acides nucléiques dans leur ensemble) et présente une sensibilité aux contaminants, de sorte qu'elle exige un ADN très pur pour être précise. En savoir plus sur la pureté de l'ADN, la façon de la mesurer et son incidence sur la quantification.
L'absorbance des échantillons d'ADN à 260 nm est actuellement le plus souvent mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre à microvolume, mais il est également possible d'utiliser un spectrophotomètre à cuvette ou un lecteur de microplaques.
Dans cette méthode, la concentration d'une substance est calculée selon la loi de Beer-Lambert en fonction de son absorbance. La formule suivante peut être obtenue à partir de la formulation originale de la loi:
Où A = absorbance à une longueur d'onde donnée, ε = coefficient d'extinction, b = longueur du trajet du spectrophotomètre, c = concentration de l'échantillon.
Ainsi, pour une longueur de trajet de 1 cm, la concentration est égale à l'absorbance à 260 nm (le pic d'absorption des acides nucléiques), divisée par le coefficient d'extinction.
Formule pour calculer la concentration d'ADN
L'ADNdb a un coefficient d'extinction de 0,02 (µg/mL)-1 cm-1, d'où :
La même formule peut être utilisée avec les coefficients d'extinction respectifs pour l'ADNs (absorbance x 37 µg/mL) et l'ARNs (absorbance x 40 µg/mL). Toutefois, il est important de noter que la formule n'est valable que pour les grandes molécules d'acide nucléique ayant une proportion similaire de tous les nucléotides, comme l'ADN génomique, les plasmides, etc. Pour les oligonucléotides et autres molécules d'acide nucléique courtes comme les miARN, le coefficient d'extinction doit être calculé à partir de la séquence de l'oligonucléotide.
La méthode de la diphénylamine (Dische's Test)
Une autre méthode de quantification de l'ADN par absorbance est la méthode de la diphénylamine, qui repose sur la réaction de la diphénylamine avec le sucre désoxyribose pour former un complexe bleu. Cette méthode prend du temps, a une faible sensibilité et n'est donc plus utilisée dans la plupart des laboratoires. Toutefois, la mesure est effectuée dans le domaine visible et peut être réalisée à 595 nm avec un lecteur ELISA standard si aucun autre instrument n'est disponible.