ABSORBANCE OU FLUORESCENCE?

Les méthodes les plus courantes pour la quantification de l'ADN sont la spectrophotométrie UV et la mesure de la fluorescence des colorants fixant l'ADN. La première méthode nécessite un système de mesure adapté à la mesure de l'absorpbance et la dernière nécessite un dispositif pouvant être utilisé pour la mesure de la fluorescence. Par conséquent, la première décision à prendre avant de choisir un instrument est la méthode de quantification de l'ADN à utiliser. En savoir plus sur les méthodes de quantification de l'ADN.

LECTEURS D'ABSORBANCE

Les deux options les plus importantes, pour la quantification de la concentration d'ADN par des mesures d'absorbance, sont les spectrophotomètres de microvolume et les lecteurs de microplaques d'absorbance.
 

Spectrophotomètre microvolume

Dans le passé, le spectrophotomètre à cuve était la seule option disponible pour quantifier la concentration d'ADN par des mesures d'absorbance. Cependant, son application était très limitée en raison du grand volume d'échantillon requis et du petit volume d'échantillon disponible en biologie moléculaire. Bien que la sensibilité d'un spectrophotomètre à cuve soit meilleure que celle d'un spectrophotomètre microvolume, la quantité d'échantillon nécessaire est très importante : 300-400 µL dans les cuves semi-micro et 70 µL dans les cuves ultra-micro. Une véritable percée dans l'application de la méthode n'a été réalisée qu'avec l'introduction des spectrophotomètres microvolumes, qui permettent de mesurer de minuscules gouttes de l'échantillon (généralement 1 µL). Par conséquent, les spectrophotomètres à cuve pour la quantification de l'ADN ont, depuis, été largement abandonnés, et les spectromètres microvolumes sont l'instrument de choix pour les mesures d'absorbance d'un seul échantillon.

La quantification de l'ADN avec un spectrophotomètre microvolume est simple et directe, mais les échantillons doivent être mesurés individuellement avec une courte étape de nettoyage entre les échantillons, ce qui est plutôt long lorsqu'il faut quantifier un grand nombre d'échantillons. C'est pourquoi l'utilisation d'un lecteur de microplaques est recommandée pour mesurer plus d'échantillons en moins de temps.

Lecteurs de microplaques à absorbance

Les lecteurs de microplaques peuvent mesurer de nombreux échantillons en peu de temps : Les formats de plaque typiques sont les 96 et 384 puits, mais certains lecteurs peuvent également lire des plaques de 1536 puits ou plus. Cependant, ils présentent certaines limites dans le calcul des concentrations d'ADN par rapport aux spectrophotomètres microvolumes :

  • Ils nécessitent des volumes d'échantillons plus importants pour la mesure. Cela dépend du type de plaque et du fabricant. Plus la densité des puits est élevée, plus le volume de travail minimum est faible, et il existe des versions à faible volume des formats de microplaques les plus courants. Dans la plupart des cas, cependant, la mesure sur microplaques nécessite encore plusieurs fois le volume de l'échantillon par rapport à la mesure sur un spectrophotomètre microvolume. Dans le tableau à la fin de cet article, vous trouverez le volume de travail minimum des formats de microplaques les plus courants
  • Les microplaques de polystyrène standard ne peuvent pas être utilisées car elles bloquent les rayons UV. Des microplaques spéciales transparentes aux UV sont actuellement disponibles auprès de la plupart des grands fabricants. Bien qu'elles soient plus chères que les microplaques en polystyrène, elles sont plus abordables et plus pratiques que les microplaques en quartz ou à fond de quartz.
  • La longueur du trajet, qui est un facteur dans la formule de calcul de la concentration d'ADN (voir les méthodes de quantification de l'ADN) dépend de la géométrie du puits et du volume de l'échantillon. Comme la formule de calcul de la concentration d'ADN nécessite une longueur de trajet de 1 cm, la correction de la longueur de trajet doit être utilisée dans les mesures sur microplaques. La correction de la longueur du trajet peut être facilement calculée en mesurant l'absorbance des échantillons à 900 et 975 nm.

Microplaques microvolumes pour la quantification de l'ADN

Une solution pour ces trois problèmes est l'utilisation de microplaques en microvolume pour la quantification de l'ADN. Ce type de microplaques utilise de petits volumes d'échantillons (généralement 2 µL), est transparent aux UV et possède une longueur de trajet fixe qui peut être facilement appliquée aux calculs sans mesure supplémentaire. Bien qu'elles n'aient pas autant de positions d'échantillon que les microplaques standard (normalement 16 au lieu de 96), elles offrent un bon compromis entre le volume d'échantillon et le débit. Pour une quantification pratique de l'ADN dans nos lecteurs de microplaques, nous proposons la plaque µDrop, qui comprend des fichiers de paramètres pour une mesure et un calcul faciles à l'aide du logiciel MikroWin.

En ce qui concerne le choix du lecteur de microplaques, la seule condition requise est de pouvoir mesurer l'absorbance dans les UV jusqu'à 230 nm (car cette longueur d'onde est utilisée pour évaluer la pureté de l'ADN). Les lecteurs à base de filtre et à monochromateur conviennent à cette application.