LA PURETÉ DE L'ADN EN SPECTROPHOTOMÉTRIE UV
Comme nous l'avons décrit dans la discussion sur les méthodes de quantification de l'ADN, la mesure de l'absorbance d'un échantillon à 260 nm est une méthode largement utilisée pour quantifier la concentration d'ADN. Cependant, d'autres macromolécules absorbent à 260 nm : principalement des protéines et de l'ARN, mais aussi des substances utilisées pour la purification. La contamination de l'échantillon par des substances qui absorbent à 260 nm conduit à une surestimation de la quantité d'ADN et donc éventuellement à une concentration d'ADN plus faible que celle requise pour une procédure ultérieure en aval. Beaucoup de ces impuretés peuvent être estimées en mesurant l'absorption de l'échantillon à des longueurs d'onde autres que 260 nm.
A340
Une absorbance élevée à environ 340 nm (ou 320 nm) est un indicateur de la présence de particules en suspension. Comme elles n'influencent normalement pas les méthodes en aval, l'A340 n'est généralement soustrait de la mesure de l'absorbance que pour corriger l'influence des particules sur la quantification. Cette soustraction est parfois appelée normalisation du spectre.
A260/A280 ratio
Les protéines ont une absorption plus élevée à 280 nm qu'à 260 nm. Le rapport entre les absorbances à 260 (A260) et 280 nm (A280) est largement accepté comme moyen d'évaluer la contamination des protéines dans un échantillon d'ADN purifié. Le rapport A260/A280 d'un échantillon contenant de l'ADN pur sans contamination protéique devrait être compris entre 1,8 et 2,0, les valeurs inférieures à 1,8 indiquant une contamination par des protéines, et les rapports supérieurs à 2,0 indiquant une contamination par l'ARN. Un faible rapport A260/A280 peut également indiquer la présence de phénol, un additif utilisé dans certaines méthodes de purification de l'ADN.
La sensibilité du rapport A260/A280 pour la détection de la contamination par les protéines est très faible : un rapport de 1,75 - c'est-à-dire seulement 0,05 en dessous de 1,80 - pourrait déjà indiquer une teneur en protéines d'environ 50% dans l'échantillon. Dans cet exemple, notre concentration d'ADN ne serait en fait que la moitié de la concentration calculée par A260. Bien que certains systèmes proposent une concentration d'ADN corrigée en fonction de l'écart du spectre de l'échantillon par rapport au spectre théorique de l'ADN pur, les quantités élevées de protéines nécessaires pour que la différence soit mesurable rendent cette correction peu fiable.
A260/A230 ratio
Les protéines ne sont pas le seul contaminant possible dans les échantillons d'ADN purifiés. Certains contaminants courants provoquent une augmentation relative de l'absorbance à 230 nm par rapport à 260 nm, et le rapport A260/A230 est donc également utilisé pour évaluer la pureté de l'ADN. Le rapport A260/A230 de l'ADN pur est de 1,8. Un rapport inférieur indique une contamination par le phénol, l'EDTA, le thiocyanate de guanidine, le Triton X-100 ou les hydrates de carbone. La contamination par les protéines augmente également ce rapport, mais le rapport A260/A280 est normalement préféré comme indicateur de la contamination par les protéines, car il n'est pas affecté par un éventail aussi large de contaminants possibles.
LIMITES DE LA SPECTROPHOTOMÈTRIE UV POUR ÉVALUER LA PURETÉ DE L'ADN
La limite de détection de la spectrophotométrie UV est généralement de 2 ng/µL d'ADN. Cela signifie qu'il n'est pas possible d'évaluer la pureté des échantillons d'ADN en dessous de cette concentration en utilisant cette méthode. Même à des concentrations proches de la limite de détection, les rapports A260/A280 et A260/A230 sont trop imprécis pour évaluer la pureté de l'ADN. Cela est dû au fait que les valeurs mesurées sont très proches de la limite de détection de l'instrument, où la variabilité de la mesure par rapport aux valeurs mesurées est énorme, et les valeurs A280 et A230 sont encore plus faibles que celles de A260, et donc plus proches de la limite de détection de l'instrument. Par exemple, la valeur A260 d'un échantillon contenant 2 ng/µL d'ADN pur serait de 0,04, et donc, sa valeur théorique A280 serait de 0,02. Mais une oscillation de seulement 0,01 ferait passer les rapports de 4,0 (avec une oscillation de -0,01 pour une valeur mesurée de 0,01) à 1,33 (avec une oscillation de +0,01 pour une lecture de 0,03). Il n'est donc pas rare que les ratios donnent des valeurs même négatives parce que A280 ou A230 est inférieur à 0.
LA PURETÉ DE L'ADN À L'AIDE DE COLORANTS FLUORESCENTS
Comme des colorants fluorescents sont disponibles pour des espèces d'acide nucléique spécifiques (par exemple, l'ADNdb), la contamination par des protéines ou d'autres espèces d'acide nucléique a très peu d'impact sur la quantification de l'ADN par cette méthode. Par conséquent, si la pureté de l'ADN dans l'échantillon n'est pas très bonne, les concentrations d'ADN rapportées par A260 peuvent être plus élevées que celles rapportées lors de l'utilisation de colorants fluorescents. Cependant, la quantification de l'ADN à l'aide de colorants fluorescents ne fournit pas une estimation directe de la présence de contaminants (ce qui peut être important, par exemple, pour évaluer les effets possibles sur les méthodes en aval). Si la présence de protéines ou d'ARN contaminants doit être quantifiée (par exemple, pour optimiser le processus de purification), il faut alors prélever plusieurs aliquotes de l'échantillon, et chaque macromolécule doit être quantifiée séparément.
INTÉGRITÉ DE L'ACIDE NUCLÉIQUE
Enfin, quelques mots sur l'évaluation de l'intégrité des acides nucléiques et, en particulier, de l'ARN. Si le spectre de l'échantillon est très instructif sur la pureté des acides nucléiques extraits (si le spectre diffère beaucoup de celui des acides nucléiques purs et indique donc une faible pureté), il ne fournit aucune information sur son intégrité. Cela est dû au fait que le spectre d'absorption des nucléotides libres est identique à celui des nucléotides appartenant à une grande molécule d'ADN ou d'ARN.
Pour évaluer l'intégrité de l'ARN, le meilleur moyen est encore d'effectuer une électrophorèse sur gel et de visualiser l'ADN à l'aide d'un colorant d'intercalation. La présence de frottis de faible poids moléculaire est révélatrice d'une dégradation de l'ARN. Les intensités relatives des ARNr 28S et 18S peuvent être utilisées pour calculer l'intégrité de l'ARN, un rapport de 2:1 est indicatif d'un ARN intact.