¿Por qué usar un monocromador en un lector de microplacas?
Los lectores de microplacas se utilizan en una amplia gama de métodos en muchos campos científicos. Algunos métodos, como la luminiscencia, no requieren ningún medio de selección de longitud de onda, porque se consideran todos los fotones para calcular la luminiscencia de la muestra. Sin embargo, la mayoría de los métodos requieren limitar las longitudes de onda medidas a un ancho de banda estrecho: por ejemplo, medir la absorción alrededor del máximo de absorción de la sustancia de interés, excitar solo un único fluoróforo o separar la emisión de diferentes proteínas indicadoras.
Tradicionalmente se utilizaban filtros para seleccionar la longitud de onda deseada: son asequibles, fáciles de usar y ofrecen una alta sensibilidad gracias a su alta transmitancia y propiedades de bloqueo. Sin embargo, carecen de flexibilidad, ya que el uso de diferentes longitudes de onda requiere el uso de diferentes conjuntos de filtros, y no son adecuados para medir el espectro de una sustancia. Obtenga más información sobre el principio y los tipos de monocromadores.
Los monocromadores se usan en lectores de microplacas principalmente para medir la absorbancia y la intensidad de fluorescencia.
Las especificaciones de un monocromador más relevantes para los lectores de microplacas
Rango espectral (rango de longitud de onda)
Muchos lectores de microplacas en el mercado cubren un rango de absorción de 230 nm a 1000 nm. Con nuestros sistemas puede utilizar el monocromador hasta 200 nm. Cuando se mide la fluorescencia, muchos lectores de microplacas solo pueden medir hasta 700 o 740 nm. Nuestros instrumentos pueden cubrir el rango de hasta 850 nm.
Ancho de banda espectral
El ancho de banda espectral se define como el ancho en los puntos donde la luz ha alcanzado la mitad del valor máximo (full width at half maximum, abreviado FWHM). El ancho de ranura determina el ancho de banda espectral: cuanto más estrecho es el ancho de ranura, más estrecho es el ancho de banda espectral. Muchos lectores de microplacas en el mercado tienen un ancho de banda espectral fijo. Sin embargo, nuestros lectores de microplacas que están equipados con un monocromador tienen un ancho de banda variable: de 4 nm a 22 nm. Un ancho de banda más estrecho mejora la resolución y se recomienda para la fluorescencia cuando los picos de excitación y emisión están muy cerca, mientras que un ancho de banda más amplio aumenta la señal. Un monocromador con ancho de banda espectral variable es muy útil para optimizar ensayos complicados.
Eficiencia de bloqueo
La eficiencia de bloqueo es la capacidad de un sistema de selección de longitud de onda para bloquear longitudes de onda no deseadas (distintas del intervalo seleccionado en el monocromador), y es crítica para lograr una buena relación señal-ruido. Se expresa como la fracción de luz no deseada que sale del monocromador: una eficiencia de bloqueo de 10-3 significa que 1/1000 de la luz de longitudes de onda no deseadas no ha sido bloqueada y sale del monocromador. La mayoría de los lectores de microplacas usan una configuración de monocromador doble para lograr una eficiencia de bloqueo de 10-6, que se requiere para la mayoría de los ensayos de intensidad de fluorescencia.
Luz parásita
La luz parásita es la cantidad medida de luz que sale del monocromador a una longitud de onda diferente de la longitud de onda seleccionada. Es la radiación que es el resultado de imperfecciones en el elemento de dispersión u otras superficies ópticas, efectos de difracción, otras aberraciones ópticas o componentes dañados y desgastados.
En las mediciones de absorción, la luz dispersada causa desviaciones de la ley de Lambert-Beer. A altos valores de absorción, la relación lineal entre absorción y concentración está fuertemente influenciada por el factor de luz dispersada, que introduce un sesgo sistemático hacia absorciones más bajas a concentraciones crecientes. La luz parásita también es el parámetro de influencia principal para el límite superior del intervalo dinámico lineal para un análisis y también causará problemas en las mediciones de fluorescencia.
La luz parásita se expresa como una fracción de la luz que sale del monocromador: un índice de 10-4 significa que 1/10000 de la luz que sale del monocromador es luz parásita.
Mientras que la mayoría de los lectores de microplacas en el mercado tienen un índice de luz parásita entre 3 x 10-4 y 5 x 10-4, los instrumentos fabricados por Berthold Technologies cuentan con un excelente índice de 10-6, es decir, al menos 20 veces mejor, proporcionando la máxima fiabilidad en todas las mediciones basadas en monocromadores.
Resolución espectral
La resolución es el paso de banda mínimo que se puede establecer en el monocromador; una vez que los elementos del monocromador y sus posiciones están fijos, la resolución se determina por el ancho mínimo de la ranura. La resolución es crítica para determinar con precisión el espectro de una muestra. Los picos espectrales originalmente agudos se ensanchan cuando se miden a baja resolución, e incluso pueden desaparecer usando un ancho de ranura amplio; una ranura estrecha logra una forma de espectro más cercana al espectro original. En la Figura 1 se puede ver un ejemplo del impacto de la resolución en un escaneo espectral: con una resolución de 4 nm, los 3 picos alrededor de 500 nm se ven más planos que a 1 nm, pero aún son fácilmente distinguibles; con una resolución de 15 nm, sin embargo, aparecen fusionados como un solo pico, lo que resulta en una pérdida de información.
Los monocromadores utilizados en nuestros lectores de microplacas tienen una resolución espectral de 4 nm, mientras que muchos competidores solo tienen una resolución de 9, 15 o incluso 20 nm.
¿Cuándo se debe medir con filtros y cuando se utiliza un monocromador?
Esto depende del ensayo particular. Para algunas mediciones, por ejemplo, polarización de fluorescencia, deben usarse filtros porque la polarización en un monocromador no puede ajustarse fácilmente. En otros casos, tales como BRET, la sensibilidad requerida será difícil de conseguir con monocromadores.
En general, las mediciones realizadas con filtros proporcionan mayor sensibilidad que las mismas mediciones realizadas con un monocromador en un instrumento comparable. En muchos casos, sin embargo, la sensibilidad ofrecida por el monocromador es lo suficientemente buena, y la mayor flexibilidad y comodidad son ventajosas.
Los lectores de microplacas basados en monocromadores de Berthold Technologies ofrecen lo mejor de ambos mundos: usted es libre de elegir entre filtros y monocromador, proporcionando la opción que ofrece el mejor rendimiento para su ensayo.