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¿QUÉ ES LA LUMINISCENCIA? DEFINICIÓN DE LUMINISCENCIA

El término luminiscencia se refiere como la emisión de luz que no es causada por una temperatura elevada. Por eso, el fenómeno también se conoce como "luz fría".

Hay muchos procesos emisores de luz a nuestro alrededor. Se producen de forma natural o artificial. Ejemplos de luminiscencia natural son las luciérnagas y el fitoplancton (bioluminiscencia). Los diodos emisores de luz (LED) y los monitores de ordenador (electroluminiscencia) son ejemplos de luminiscencia artificial.

Tipos de luminiscencia

En Ciencias de la Vida se utilizan diferentes tipos de luminiscencia. Los diferentes tipos de luminiscencia se pueden agrupar según dos criterios diferentes: por el método de excitación de la sustancia y por la duración de la emisión de la señal.

A. Tipos de luminiscencia según el método de generación de sustancia de alta energía:

La mayoría de los tipos de luminiscencia implican una sustancia de alta energía que pierde energía en forma de luz. El mecanismo por el cual se genera esta sustancia o consigue que la energía “extra” se libere en forma de luz es una forma útil de clasificar la luminiscencia.

 

1. Quimioluminiscencia

La quimioluminiscencia describe la emisión de luz como resultado de una reacción química. La entalpía de la reacción proporciona la energía necesaria, produciendo un producto excitado o intermedio. Cuando el intermedio cae a su estado fundamental, emite un fotón.

1.1 Bioluminiscencia

Si tal reacción tiene lugar en un organismo vivo, p. en las luciérnagas, esto se llama bioluminiscencia. Esta reacción bioquímica involucra una molécula emisora de luz llamada luciferina y una enzima llamada luciferasa. Las luciferasas son una familia de fotoproteínas que se pueden encontrar en varios insectos, organismos marinos y procariotas [1]. Estas enzimas catalizan la oxidación de la luciferina, dando como resultado la emisión de fotones. Dependiendo del organismo, la enzima y el sustrato producidos, así como los cofactores necesarios, son diferentes. Como resultado, la longitud de onda de emisión de la luz producida varía produciendo espectros de emisión que oscilan entre 400 nm y 620 nm.

Una de las luciferasas más utilizadas en ciencias biológicas es la luciferasa Firefly, que emite luz de color amarillo verdoso a aproximadamente 550 - 570 nm. Otro gran ejemplo es la Renilla Luciferasa del pensamiento marino Renilla reniformis, que emite luz azul a 480 - 500 nm.

2. Fotoluminiscencia

La fotoluminiscencia describe la luminiscencia de una sustancia excitada (es decir, llevada a un nivel de energía más alto) por la luz, generalmente ultravioleta o visible. Esto se llama fotoexcitación y es el resultado de mover electrones a niveles energéticamente más altos a través de la absorción de fotones. Como resultado de la excitación, generalmente ocurren varios procesos de relajación en los que normalmente se reemiten fotones de menor energía. La fluorescencia y la fosforescencia son los principales tipos de fotoluminiscencia, y una molécula con propiedades fluorescentes se llama fluoróforo. En las ciencias de la vida, este tipo de luminiscencia se utiliza habitualmente en ensayos de fluorescencia.

BRET y FRET implican un tipo especial de transferencia de energía que podría considerarse como una forma de fotoluminiscencia. En ambos métodos hay dos moléculas o grupos, un donante y un aceptor, siendo el donante una luciferasa (en BRET) o un fluoróforo (en FRET), y el aceptor es un fluoróforo que puede excitarse en la longitud de onda de emisión del donante. La excitación del aceptor por parte del donante recuerda a la fluorescencia; sin embargo, tanto en BRET como en FRET, el exceso de energía se transporta al aceptor a través de un proceso no radiativo en forma fotón virtual; esta transferencia es facilitada por acoplamientos dipolo-dipolo entre moleculas y se llama resonancia. El término "virtual" indica el hecho de que el fotón se reabsorbe antes de que sus propiedades, como la longitud de onda, adquieran significado físico [3].

3. Electroluminiscencia

La electroluminiscencia describe la generación de luz como resultado de una corriente eléctrica que pasa a través de una sustancia. En ciencias biológicas, esto se usa típicamente en algunas formas de inmunoensayo y en inmunoquímica para aplicaciones clínicas.

El inmunoensayo electroquimioluminiscente (ECLIA) [2] es un método altamente sensible en el que se genera un intermedio electroquímico a partir de precursores estables (es decir, la etiqueta activa ECL) en la superficie de un electrodo. La molécula emite luz cuando se relaja a un nivel de energía más bajo.

 

4. Radioluminiscencia

La radioluminiscencia ocurre cuando sustancias específicas son impactadas por radiación ionizante como los rayos α, β o γ. En el pasado reciente (década de 1960) este fenómeno se utilizaba para hacer que las esferas de los relojes brillaran en la oscuridad.

Este principio se usa para la separación y detección de trazadores radiactivos mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (radio HPLC) en diversas aplicaciones farmacéuticas y clínicas. En la radio HPLC, un electrón golpea una molécula centelleadora y la eleva a un nivel de energía más alto. El centelleador vuelve inmediatamente a su nivel de energía inicial emitiendo fotones. Estos fotones son detectados por un tubo fotomultiplicador (PMT).

En el campo de las ciencias biológicas, el término "luminiscencia" se utiliza principalmente para referirse a la quimioluminiscencia (y, por extensión, a la bioluminiscencia) en lugar de la fluorescencia. Pero, como has visto anteriormente, la fluorescencia es un subtipo de luminiscencia. Obtenga más información sobre las diferencias entre luminiscencia, fluorescencia y fosforescencia. Como esta es la convención habitual en el campo, en el resto del artículo usaremos el término luminiscencia para referirnos tanto a quimioluminiscencia como a bioluminiscencia, a menos que se indique lo contrario.

B. Tipos de luminiscencia según la duración de la emisión de la señal.

1. Luminiscencia "flash"

Los ensayos que producen una señal corta pero intensa se denominan ensayos flash. La vida media de la señal de estos ensayos suele estar en el rango de unos pocos minutos o incluso menos. El desafío en los ensayos flash es que, una vez que se agrega el reactivo, la señal alcanza su punto máximo casi inmediatamente y luego disminuye rápidamente. Esto no es un problema cuando se utiliza un luminómetro de un solo tubo, ya que cada muestra se puede medir individualmente inmediatamente después de agregar la sustancia que inicia la reacción. Pero, ¿y si se mide en un luminómetro de microplacas?

Si se iniciara la reacción en todos los pocillos simultáneamente en una placa de 96 pocillos y luego se midiera secuencialmente, solo se medirían los primeros pocillos en el pico de intensidad de la señal. Sin embargo, en los pocillos medidos posteriormente, la intensidad de la señal luminiscente ya se habría reducido significativamente.

Por lo tanto, la medición de ensayos flash en un lector de microplacas requiere el uso de los llamados inyectores. De esta manera, se puede añadir primero el reactivo iniciador en cada pocillo y medir la señal inmediatamente. El ensayo Dual-Luciferase Reporter™ y los ensayos SPARCL son ejemplos de ensayos de tipo flash.

2. Luminiscencia "glow"

Los ensayos de tipo glow, por otro lado, generan una intensidad de señal que dura horas. Aunque la intensidad de la señal se reduce en comparación con los ensayos flash, el flujo de trabajo mucho más simple debido a la mayor estabilidad de la señal, que no requiere inyectores de reactivos, lo que hace que esta forma de  luminiscencia sea el método de elección en muchos ensayos. Sin embargo, como todos los pocillos emiten luz al mismo tiempo, es posible que la luz proveniente de pocillos adyacentes interfiera en la medición, en un fenómeno llamado crosstalk (ver más abajo).