Unidades de sensibilidad
La mayoría de las especificaciones del lector de microplacas expresarán su sensibilidad como una cantidad de una sustancia, típicamente ATP o luciferasa para luminiscencia y fluoresceína para fluorescencia. Para otras tecnologías de detección, podría ser cualquier otra sustancia que sea detectada por un kit que utilice esa tecnología. También usarán términos como femtomol, attomol y zeptomol. Entonces, ¿qué significan estos términos?
Como saben, el número de Avogadro es el número de moléculas en un mol de sustancia. Tiene un valor de 6.022 x 1023. Así, un mol de una sustancia consta de 602.250.000.000.000.000.000.000 de moléculas:
- Un femtomol es 1 x 10-15 o una cuatrillonésima parte de un mol (0,000000000000001). Esto es ~602.200.000 moléculas (número de Avogadro X (1 x 10-15).
- Un attomol es 1 x 10-18, que es una quintillonésima parte de un mol (0,000000000000000001), es decir, ~ 602,200 moléculas.
- Un zeptomol es 1 x 10-21 que es una sextillonésima de un mol (0,000000000000000000001), es decir, ~602 moléculas.
Como se puede ver en lo anterior, esto significa que estamos tratando con números extremadamente pequeños, especialmente a nivel de zeptomoles. Entonces, ¿cómo podemos usar todo esto para evaluar el rendimiento de cualquier instrumento? Hay dos criterios clave que debemos tener en cuenta: el límite inferior de detección (sensibilidad) y el coeficiente de variación.
- El límite inferior de detección es la cantidad mínima de muestra que genera una respuesta del instrumento por encima del ruido de fondo y se denomina sensibilidad.
- El coeficiente de variación es el porcentaje de cambio sobre un conjunto de lecturas a lo largo del tiempo; esto implica la consistencia de la medición.
El coeficiente de variación y el límite inferior deben obtenerse utilizando únicamente patrones conocidos.
Calcular el límite inferior de detección
En Berthold solo utilizamos estándares conocidos y la siguiente fórmula para calcular el límite de detección:
ConcentraciónS | concentración de la señal estándar* en pg/mL |
| StdevB | desviación típica de los pocillos llenos de blanco |
| meanS | media de pocillos con estándar* |
| meanB | media de pocillos llenos de blanco |
* Cualquier punto estándar con lecturas medias al menos 100 veces por encima de las lecturas medias del blanco.
Como consecuencia de la fórmula anterior, un fondo estable se vuelve realmente importante: tomamos 3 desviaciones estándar del valor medio del fondo, que es > 99% de la distribución normal. Un instrumento sensible tendrá una clara distinción entre el ruido en blanco y la señal de muestra. Echa un vistazo al siguiente ejemplo para ver el impacto de una mayor variación de fondo:
Instrumento 1 | Instrumento 2 | |
|---|---|---|
| meanB | 50 | 15 |
| StdevB | 10 | 15 |
ConcentraciónS (pg/mL) | 100 | 100 |
Estándar de señal | 100,000 | 100,000 |
Señal/ruido | 2,000 | 6,667 |
Límite de detección calculado | 0.030 | 0.045 |
Aunque el instrumento 2 tiene una señal de fondo más baja, es menos sensible debido a su desviación estándar de fondo más alta. Un límite inferior de detección (sensibilidad) puede ayudarle a ahorrar tanto dinero como tiempo, si la detección de señales cercanas al límite de detección es clave: por un lado, le ayuda a reducir el consumo de reactivos caros o células valiosas; por otro lado, puede reducir significativamente el tiempo de lectura por muestra y ahorrar un valioso tiempo total de operación. Como consecuencia, la estabilidad del detector utilizado en su instrumento es extremadamente importante cuando se mira la sensibilidad. Esta es la razón por la que en Berthold seleccionamos manualmente nuestros tubos multiplicadores (PMT) y los probamos para los siguientes parámetros a diversas temperaturas para garantizar los mejores resultados:
- Bajo nivel de ruido, fondo estable
- Eficiencias azul/verde/rojo
- Estabilidad a largo plazo
- Alta eficiencia de detección
Para nuestros lectores de microplacas solo se utilizan PMT con bajo ruido, fondo estable, altas eficiencias y estabilidad a largo plazo a las temperaturas de laboratorio habituales. Esto garantiza el rendimiento que necesita para una investigación exitosa. Esto hace que el luminómetro de placas Centro XS y el lector multimodo Tristar 5 sean los instrumentos más sensibles de su clase.