La lectura desde arriba suele ser más sensible
La lectura desde arriba normalmente proporciona mejores relaciones reñal/ruido para ensayos basados en solución, tales como cuantificación de DNA o cuantificación de proteínas. En general, la lectura de la fluorescencia desde arriba es más sensible que la lectura desde la parte inferior. Esto es el resultado de que la luz es atenuada y dispersada por los plásticos del fondo del pocillo, lo que puede aumentar el ruido de fondo y disminuir la eficiencia de la medición. Por lo tanto, la calidad y el grosor del plástico transparente inferior y el tipo de fluoróforo son consideraciones importantes al diseñar su ensayo.
El tipo de microplaca es crítico para la lectura inferior
Otro factor a considerar es, por supuesto, el tipo de microplaca que esté utilizando. Por supuesto, el fondo tiene que ser transparente, pero ¿está usando una microplaca de cultivo de paredes opacas? ¿La placa es blanca o negra? ¿El fondo transparente está hecho de poliestireno o de vidrio?
Responder a las preguntas anteriores está estrechamente relacionado con la longitud de onda de la luz de interés. Si usted está tratando de detectar la luz visible (350-900 nm) por lo general un fondo de plástico es suficiente. Sin embargo, la detección por debajo de 350 nm requiere un fondo hecho de material transparente a los rayos UV, por ejemplo, cuarzo o polímeros COP/COC. Como último recurso, se pueden usar las placas ópticas con fondo de vidrio, que son más caras pero permiten la detección tanto desde la parte superior como desde la parte inferior, así como la visualización microscópica con bajo fondo de las células.
La diferencia clave entre las placas blancas y negras son sus propiedades reflectantes. Las placas blancas reflejan la luz y maximizarán la señal. Por otro lado, las placas negras absorben la luz y reducen fondo y crosstalk. Por lo tanto, las placas blancas se usan habitualmente para ensayos luminiscentes, mientras que las placas negras se usan para ensayos fluorescentes.
¿Cuándo proporciona mejores resultados la lectura desde abajo ?
- Cuando se trabaja con células adherentes que crecen en la parte inferior de la placa y expresan, se unen o secretan un fluoróforo solamente en o cerca de su lado de unión inferior.
- Ensayos de quimiotaxis que realizan un seguimiento de la migración de las células a través de una membrana. Esto se analiza típicamente mediante una combinación de ambas lecturas, desde arriba y desde abajo.
- Ciertos ensayos basados en células (por ejemplo, GeneBLAzer® o QBT™ Fatty Acid Uptake) no se pueden leer desde la parte superior ya que las propiedades ópticas de los reactivos utilizados en el ensayo interfieren con la excitación o emisión del fluoróforo.
Si aún tiene dudas sobre qué tecnología de lectura usar, puede programar su lector de microplacas para que ejecute un protocolo que incluya tanto la lectura superior como la inferior y comparar los resultados para hacer su elección final.
GeneBLAzer® es una marca registrada de Invitrogen Corporation.
QBT™ Fatty Acid Uptake es una marca comercial de Molecular Devices.