La distancia entre la longitud de onda central de los filtros de excitación y emisión debe ser de al menos 50 nm. Muy a menudo, los picos de excitación y emisión están muy juntos, pero es importante evitar cualquier superposición de la longitud de onda de ambos filtros; para lograr esto, puede seleccionar fácilmente filtros de excitación para una longitud de onda más corta que el pico de excitación, y filtros de emisión para una longitud de onda más larga que el pico de emisión, y aún así atrapar suficiente luz para una buena relación señal-fondo.
