La importancia de la medición intracelular del calcio
El calcio bivalente es un mensajero intracelular en muchas rutas de transducción de señales eucariotas. La mayoría de los sistemas de señalización de calcio tienen una cosa en común: generan breves pulsos de calcio, regulando así las funciones celulares.
Los niveles intracelulares de calcio generalmente se mantienen bajos, ya que el calcio a menudo forma complejos insolubles con compuestos fosforilados y carboxilados. Típicamente, las concentraciones de calcio citosólico son de 100 nM. En respuesta a los estímulos, el calcio se libera del medio externo o de las reservas internas para elevar la concentración de calcio.
MEDICIÓN DE CALCIO INTRACELULAR MEDIANTE LUMINISCENCIA
La monitorización de los cambios en los niveles de calcio intracelular por medio de aequorina en una reacción luminiscente de tipo flash es altamente eficaz. Los ensayos para ambos, la activación de los receptores acoplados a la proteína G (también conocidos como GPCR o receptores 7TM) que inducen la degradación de fosfolípidos de inositol y la actividad de los canales de iones de calcio regulados por voltaje, causando este último un flujo de entrada bastante lento, se pueden realizar fácilmente con el uso de los inyectores de reactivos del luminómetro Centro y los lectores de microplacas Tristar 3 y 5.
MEDICIÓN DEL CALCIO INTRACELULAR MEDIANTE FLUORESCENCIA
Además, la concentración de calcio libre en células intactas puede monitorizarse usando quelantes policíclicos tales como Fura-2 o Indo-1. Fura-2 e Indo-1 proporcionan una lectura ratiométrica, reduciendo de este modo los efectos causados por el fotoblanqueo de los fluoróforos o por condiciones de ensayo variables.
Las propiedades de ambos fluoróforos cambian notablemente cuando se unen a calcio y, por lo tanto, es posible la detección directa de flujos de calcio en respuesta a rutas de transducción de señales específicas. El máximo de emisión de Indo-1 cambia de ~475 nm en medio libre de calcio a ~400 nm cuando el fluoróforo está saturado con calcio. Con Fura-2, el máximo de absorción de Fura-2 cambia de 380 nm a 340 nm al unirse al calcio, mientras que la emisión permanece constante a 510 nm. Esto da como resultado un cambio opuesto de la intensidad de fluorescencia: un aumento a 340 nm y una disminución a 380 nm.
El cambio de filtro en nuestros lectores de microplacas multimodo es extremadamente rápido (~150 ms), lo que permite una alta resolución de detección cuando se deben monitorear cambios rápidos en la concentración de calcio. Usando al menos un inyector situado en la posición de lectura, se pueden monitorizar cinéticas rápidas.
El agente fluorescente Fluo-4 también se puede usar para monitorear los cambios de calcio intracelular, y tiene la ventaja de usar una sola medición, por lo que no es necesario un cambio de filtro. Esto es beneficioso si los cambios en los niveles de calcio intracelular son demasiado rápidos para el instrumento que se usa (por ejemplo, si usa un monocromador o tiene un cambio lento de filtro). Sin embargo, no es ratiométrico y, por lo tanto, es más propenso a la variabilidad del ensayo, fuga de luz y fotoblanqueo.
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INSTRUMENTOS RECOMENDADOS PARA MEDICIONES INTRACELULARES DE CALCIO
Como se mencionó anteriormente, se recomiendan inyectores en posición de medición para mediciones de calcio intracelular usando luminiscencia, y filtros de conmutación rápida para mediciones usando fluorescencia. Todos los lectores de microplacas a continuación cumplen con esas recomendaciones.
Los luminómetros de tubo equipados con inyectores también se pueden usar para mediciones de calcio intracelular usando luminiscencia, y también son adecuados si el número de muestras a determinar es bajo. En los luminómetros de tubo los inyectores están siempre en posición de medición.