PRINCIPIO DE BRET
BRET se basa en el hecho de que la energía derivada de una reacción de luciferasa se puede usar para excitar una proteína fluorescente si esta última está muy cerca de la primera. La tecnología implica la fusión de moléculas donantes (luciferasa) y aceptoras (fluorescentes) a proteínas de interés. La coexpresión de constructos de fusión en células vivas permite estudiar su interacción en tiempo real de manera cuantitativa. La energía se transfiere a través del acoplamiento dipolo-dipolo no radiactivo desde el donante al aceptor cuando estos se encuentran en estrecha proximidad (típicamente, dentro de 10 nm), dando como resultado la emisión de fluorescencia a una longitud de onda característica. La energía emitida por el aceptor con respecto a la emitida por el donante se denomina señal BRET, o relación BRET. Depende de las propiedades espectrales, la relación de concentraciones, la distancia y la orientación relativa de las moléculas donante y aceptora, así como de la fuerza y estabilidad de la interacción entre las proteínas de interés.
BRET es muy similar a FRET, pero en FRET también el donante es una proteína fluorescente que tiene que ser excitada. Como BRET no requiere una fuente de luz externa para excitar al donante, tiene un fondo muy bajo y no sufre de los problemas a menudo asociados con FRET, como autofluorescencia, dispersión de la luz o fotoblanqueo. Otras ventajas de BRET son que es una tecnología no radiactiva y homogénea, y que la señal ratiométrica minimiza las interferencias de las condiciones de ensayo.
MÉTODOS BRET
En los últimos años se han desarrollado diferentes métodos BRET. Todos ellos tienen sus propios beneficios y limitaciones. En la tabla siguiente se pueden encontrar varios pares de donantes y aceptores y sus longitudes de onda correspondientes:
Método | Donante | Sustrato | Emisión del donante [nm] | Aceptor | Emisión del aceptor [nm] |
|---|---|---|---|---|---|
| BRET 1 | RLuc | Coelenterazine | 480 | eYFP | 530 |
| BRET 2 | RLuc | Coelenterazine 400a (Deep Blue C™) | 395 | GFP | 510 |
| eBRET 2 | RLuc8 | Coelenterazine 400a (Deep Blue C™) | 395 | GFP | 510 |
| BRET 3 | Firefly | Luciferin | 565 | DsRed | 583 |
| QD-BRET | RLuc/RLuc8 | Coelenterazine | 480 | QDot | 605 |
| NanoBRET | NanoLuc® | Furimazine | 460 | HaloTag® Ligand | 618 |
BRET 1
El método BRET original que utiliza Coelenterazina como sustrato se llama hoy en día BRET 1. Se caracteriza por señales intensas y de larga duración.
BRET 2
En comparación con BRET 1, tiene picos de emisión de donante y aceptor mejor separados. Esto hace que BRET 2 sea una mejor opción para los ensayos de cribado en los que se requieren altas relaciones de señal a ruido. Una clara limitación de BRET 2 es la baja intensidad y duración de la luz emitida.
BRET 2 mejorado (eBRET)
eBRET produce una señal aproximadamente 5 veces más intensa que en la versión original de BRET 2. eBRET utiliza un nuevo mutante de luciferasa Renilla, Rluc8.
BRET 3
La luciferasa de luciérnaga (firefly) en BRET 3 muestra una autofluorescencia celular más baja a la longitud de onda de emisión (565 nm), pero las desventajas son señales débiles y solapamiento entre los picos de emisión del donante y del aceptor.
QD-BRET
Una nueva versión de BRET es el Quantum Dot-BRET (QD-BRET). Los picos de emisión están claramente separados, lo que hace que QD-BRET sea ideal para aplicaciones de cribado. Las desventajas son el gran tamaño de las moléculas QD (1,5-6 nm) y el hecho de que la codificación genética de las proteínas QD no es posible. Las proteínas QD no pueden expresarse en células vivas, sino que deben añadirse.
NanoBRET™
NanoBRET™ utiliza una luciferasa mucho más brillante que las luciferasas convencionales, NanoLuc®, y tiene muy buena separación entre la emisión del donante (460 nm) y la emisión del aceptor (618 nm).
APLICACIONES DE BRET
BRET se puede medir en lectores de microplacas para estudiar las interacciones proteína-proteína, especialmente en el campo de la investigación de receptores acoplados a proteína G. La capacidad de estudiar las interacciones en células vivas de mamíferos evita muchos de los problemas asociados con técnicas como la coinmunoprecipitación y el cribado de levadura de dos híbridos. Además, la alta sensibilidad de BRET permite el estudio de proteínas a concentraciones fisiológicas, una ventaja significativa sobre técnicas que requieren altos niveles de expresión de proteínas.
La tecnología BRET ofrece, especialmente en el campo de la investigación de receptores acoplados a proteína G, la oportunidad de establecer un ensayo homogéneo, universal y funcional, aprovechando el hecho de que la ß-arrestina (que desempeña un papel en la desensibilización de los receptores de forma natural) se une a la parte intracelular del receptor activado. Los receptores acoplados a proteína G, también denominados receptores 7TM, comprenden la superfamilia de proteínas más grande y diversa conocida. Sólo se conocen los ligandos de una pequeña parte de ellos.
Para tener una idea de la importancia de los GPCR en el descubrimiento de fármacos:
- Actualmente, ~ 30% de los fármacos están dirigidos contra los GPCR.
- Sólo el 5% de los receptores conocidos son objetivo de fármacos.
- Sólo se conocen los ligandos correspondientes al 20% del resto.
BRET publication compilation A compilation of scientific articles using Mithras or Tristar microplate readers for BRET.
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NanoBRET™ with the Mithras² Beschreibung
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NanoBRET™ with the TriStar² S Promega NanoBRET™ protein:protein interaction system with the TriStar² S Multimode Microplate Reader
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Comparison of filter sets for BRET1 using Mithras Comparison of filter sets for BRET1 assays: ß-arrestin2 (ßARR2) recruitment to the vasopressin V2 receptor using the Mithras LB 940 Multimode Microplate Reader
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Basic Considerations for BRET Assays with the Mithras Basic Considerations for Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) Assays for G-protein coupled receptor protein interactions in living cells
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BRET to monitor dynamic receptor-protein interactionswith the Mithras Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) as a means of monitoring dynamic receptor-protein interactions in living cells measured on LB 940 Mithras Multimode Microplate Reader
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BRET-based studies of receptor dynamics with Mithras Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-based studies of receptor dynamics in living cells with Berthold’s Mithras Multimode Microplate Reader
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BRET Assay for 7TM Receptors Using the Mithras A Functional BRET Assay for 7TM Receptors Using the Mithras LB 940 Multimode Plate Reader
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LECTORES DE MICROPLACAS RECOMENDADOS PARA BRET
La mejor combinación para medición de BRET es un lector de microplacas o luminómetro capaz de medir la luminiscencia con alta sensibilidad usando filtros; también se pueden usar lectores con monocromadores, pero con sensibilidad reducida. Es necesario realizar 2 mediciones a diferentes longitudes de onda, y por lo tanto se requiere un lector con al menos 2 filtros de emisión (esto no es posible, por ejemplo, en lectores que usan un único cubo de filtro con 1 filtro de excitación + 1 filtro de emisión). Todos los lectores de microplacas a continuación se recomiendan para BRET.