Técnicas PPI usando lectores de microplacas
Los lectores de microplacas son un amplio grupo de instrumentos que incluyen tanto lectores de tecnología única como lectores multimodo. La principal ventaja de los lectores de microplacas sobre otros instrumentos disponibles para medir técnicas PPI es que pueden medir muchas muestras en un tiempo relativamente corto: todos los lectores pueden medir microplacas de 96 pocillos, y algunos también pueden medir microplacas de 384 pocillos y 1536 pocillos. Además, tienen una excelente sensibilidad tanto para las mediciones de fluorescencia como de luminiscencia debido a la adopción de tubos fotomultiplicadores que pueden detectar incluso las cantidades más pequeñas de fotones. Sin embargo, en comparación con los instrumentos de formación de imágenes tales como microscopios confocales y sistemas de captación de imágenes in vivo, los lectores de microplacas prácticamente no proporcionan información espacial que permita la localización de la interacción.
Un simple lector de microplacas de absorbancia equipado con los filtros adecuados es normalmente suficiente para cuantificar la actividad de las enzimas cromogénicas usadas en los sistemas de ubiquitina escindida y de dos híbridos de levadura. Un lector de absorción basado en monocromador también es muy adecuado para esta aplicación.
Se puede usar cualquier luminómetro de placa o luminómetro de tubo para cuantificar la luminiscencia emitida durante el ensayo de complementación de luciferasa escindida. Para los ensayos BRET, sin embargo, deben usarse lectores multimodo, ya que pueden equiparse con los filtros necesarios para distinguir la emisión del aceptor de la del donante. Los ensayos BRET también se pueden realizar con monocromadores; sin embargo, la sensibilidad es mucho menor que cuando se usan filtros y, por lo tanto, no se recomienda.
Tanto FRET como Complementación de Fluorescencia Bimolecular (BiFC) pueden medirse usando cualquier lector de microplacas de fluorescencia con los filtros adecuados. Sin embargo, dado que el rango espectral de los posibles pares FRET es muy amplio, es aconsejable comprobar que cualquier fluoróforo que emita a longitudes de onda mayores de 600 nm se mantiene dentro del rango espectral del instrumento, ya que en algunos lectores la extensión del rango espectral hasta 850 o 900 nm es opcional. Al igual que en el caso de BRET, el rendimiento de FRET cuando se usan filtros es generalmente mejor que con monocromadores.
Aunque es habitual que los lectores de microplacas modernos puedan medir TR-FRET, a veces es una característica opcional que puede faltar en los instrumentos de gama baja o más antiguos. Sin embargo, el término TR-FRET apenas se usa en las especificaciones: en su lugar, busque TRF (Fluorescencia Resuelta en el Tiempo). De hecho, desde la perspectiva del instrumento, una medición TR-FRET es solo una combinación de 2 mediciones TRF: una para el donante y otra para el aceptor. Las mediciones de TR-FRET también tienen un mejor rendimiento cuando se miden con filtros en lugar de monocromadores, y en este caso también debe comprobarse que el rango espectral del instrumento permita la medición de todos los fluoróforos involucrados, ya que la medición a 665 nm es habitual en algunos ensayos de TR-FRET.
Las mediciones del tiempo de vida de fluorescencia requieren hardware muy específico y no están disponibles en ningún lector multimodo. Si bien varios instrumentos diferentes han estado disponibles en el pasado de los principales fabricantes, incluidos Tecan y Berthold Detection Systems (ahora parte de Berthold Technologies), la mayoría de ellos se han descatalogado y, actualmente, el único lector de microplacas disponible con capacidades de medición de tiempo de vida de fluorescencia es el NovaFluor PR de Fluorescence Innovations.