ELISA Directo

El ELISA directo se usa normalmente para analizar una respuesta inmunitaria a un antígeno, por ejemplo, para la tinción inmunohistoquímica de células o tejidos. Este método ELISA requiere un antígeno recubierto en una placa de múltiples pocillos. Para la detección se usa un anticuerpo que se ha conjugado directamente con un enzima. El flujo de trabajo de este método es relativamente simple, con solo unos pocos pasos requeridos.

Ventajas y desventajas del ELISA directo

Ventajas del ELISA directo

  • Simple y rápido: solo se requiere un solo anticuerpo y el flujo de trabajo consiste en pocos pasos
  • Menos propenso a errores: número relativamente pequeño de etapas de pipeteo en comparación con otros métodos de ELISA y debido al requisito de un solo anticuerpo, no hay riesgo de reactividad cruzada del anticuerpo

Desventajas del ELISA directo

  • Sensibilidad limitada: no hay paso de amplificación de señal
  • Desarrollo costoso del ensayo: cada diana de ensayo requiere un anticuerpo primario conjugado específico, lo que hace que el ensayo sea relativamente caro, también
  • Riesgo de reactividad limitada del anticuerpo: la unión de la enzima al anticuerpo puede limitar la disponibilidad espacial de sitios en el anticuerpo que deberían unirse al antígeno

ELISA indirecto

El ELISA indirecto, el método ELISA más popular, utiliza un proceso de detección de 2 pasos. En primer lugar, un anticuerpo primario no marcado se une específicamente al antígeno. En segundo lugar, un anticuerpo secundario conjugado con enzima se une específicamente al anticuerpo primario. Este método se utiliza habitualmente para determinar la concentración total de anticuerpos en las muestras.

Ventajas y desventajas del ELISA indirecto

Ventajas del ELISA indirecto

  • Flexibilidad: el anticuerpo secundario se puede usar siempre que coincida con la especie huésped del anticuerpo primario, una amplia variedad de anticuerpos secundarios marcados estén disponibles comercialmente
  • Sensibilidad: más de una molécula de anticuerpo marcado puede unirse al anticuerpo primario, ya que cada anticuerpo primario contiene varios epítopos.
  • Inmunorreactividad máxima: ninguna etiqueta interfiere con los sitios en el anticuerpo primario
  • Económico: se requieren menos anticuerpos marcados

Desventajas del ELISA indirecto

  • Flujo de trabajo más complejo: se requiere una etapa de incubación adicional para el anticuerpo secundario
  • Potencial de reactividad cruzada: señal no específica debida a la reactividad cruzada con el anticuerpo secundario

ELISA tipo sándwich

En ELISA de tipo sándwich, se usa un anticuerpo denominado "de captura" para recubrir los pocillos, que luego se une al antígeno de la muestra. A continuación, el antígeno se detecta en configuración ELISA directa o indirecta. Este método se utiliza a menudo para analizar muestras complejas.

Ventajas y desventajas del ELISA tipo sándwich

Ventajas del ELISA tipo sándwich

  • Flexibilidad y sensibilidad: se pueden utilizar métodos de detección directa e indirecta
  • Alta especificidad: se utilizan dos anticuerpos para detectar el antígeno
  • Adecuado para muestras complejas: no se requiere purificación del antígeno antes de la medición

Desventajas del ELISA tipo sándwich

  • Flujo de trabajo complejo: requiere más pasos de incubación que otros formatos ELISA
  • Requiere más optimización: se debe verificar la reactividad cruzada entre los diferentes anticuerpos utilizados

ELISA competitivo

Cada uno de los tipos de ensayo anteriores puede adaptarse para ELISA competitivo, también conocido como ELISA de inhibición. El concepto básico de este método es que el antígeno de la muestra compite con un antígeno inhibidor, que se une a una cantidad limitante de anticuerpo marcado. El antígeno inhibidor se usa para recubrir previamente la microplaca. A continuación, la muestra preincubada con el anticuerpo marcado se añade a los pocillos. La señal detectada será más débil cuanto más antígeno haya en la muestra, ya que menos anticuerpo puede unirse al antígeno en los pocillos. Este método se usa habitualmente para analizar antígenos pequeños que tienen un solo epítopo.

Ventajas y desventajas del ELISA competitivo

Ventajas del ELISA competitivo

  • Máxima flexibilidad: puede basarse en un formato ELISA directo, indirecto o tipo sándwich.
  • Mayor especificidad: el antígeno se captura y detecta específicamente
  • Muy robusto: minimiza los efectos de la dilución de la muestra y los efectos de la matriz

Desventajas del ELISA competitivo

  • Consume mucho tiempo: protocolo largo y complejo
  • Se aplican las desventajas del formato de detección seleccionado