PUREZA DEL DNA EN ESPECTROFOTOMETRÍA UV
Como se describe en la discusión sobre los métodos de cuantificación de DNA, la medición de la absorción de una muestra a 260 nm es un método ampliamente utilizado para cuantificar la concentración de DNA. Sin embargo, otras macromoléculas absorben a 260 nm: principalmente proteínas y RNA, pero también sustancias utilizadas para la purificación. La contaminación de la muestra por sustancias que absorben a 260 nm conduce a una sobreestimación de la cantidad de DNA y, por lo tanto, posiblemente a una concentración de DNA más baja que la requerida para un procedimiento posterior. Muchas de estas impurezas pueden estimarse midiendo la absorción de la muestra a longitudes de onda distintas de 260 nm.
A340
Una absorbancia a aproximadamente 340 nm (o 320 nm) es un indicador de partículas en suspensión. Dado que normalmente no influyen en ningún método posterior, la A340 generalmente solo se resta de la medición de absorbancia para corregir la influencia de las partículas en la cuantificación. Esta sustracción a veces se denomina normalización del espectro.
Relación A260/A280
Las proteínas tienen una mayor absorción a 280 nm que a 260 nm. La relación entre las absorbancias a 260 (A260) y 280 nm (A280) es ampliamente aceptada como un método para evaluar la contaminación con proteínas de una muestra de DNA purificado. La relación A260/A280 de una muestra que contiene DNA puro sin contaminación por proteínas debe estar entre 1,8 y 2,0, con valores por debajo de 1,8 indicando contaminación por proteínas y relaciones por encima de 2,0 indicando contaminación por RNA. Una relación A260/A280 baja también puede ser indicativa de la presencia de fenol, un aditivo usado en algunos métodos de purificación de DNA .
La sensibilidad de la relación A260/A280 para la detección de contaminación de proteínas es muy baja: una relación de 1,75, es decir, solo 0,05 por debajo de 1,80, ya podría indicar un contenido de proteínas de aproximadamente el 50% en la muestra. En este ejemplo, nuestra concentración de DNA en realidad sería solo la mitad de la concentración calculada por A260. Si bien algunos sistemas ofrecen una concentración corregida de DNA basada en la desviación del espectro de la muestra del espectro teórico del DNA puro, las altas cantidades de proteína requeridas para que la diferencia sea medible hacen que esta corrección no sea confiable.
Relación A260/A230
Las proteínas no son el único contaminante posible en las muestras de DNA purificado. Algunos contaminantes comunes causan un aumento relativo en la absorbancia a 230 nm en comparación con 260 nm, y por lo tanto la relación A260/A230 también es útil para evaluar la pureza del DNA. La proporción A260/A230 del DNA puro es 1,8. Una proporción menor indica contaminación por fenol, EDTA, tiocianato de guanidina, Triton X-100 o carbohidratos. La contaminación con proteínas también aumenta esta proporción, pero la proporción A260/A280 normalmente se prefiere como un indicador de contaminación de proteínas, ya que no se ve afectada por una gama tan amplia de posibles contaminantes.
Limitaciones de la espectrofotometría UV para evaluar la pureza del DNA
El límite de detección de la espectrofotometría UV es típicamente 2 ng/µL de DNA. Esto significa que no es posible evaluar la pureza de las muestras de DNA por debajo de esta concentración mediante el uso de este método. Incluso a concentraciones cercanas al límite de detección, tanto las relaciones A260/A280 como A260/A230 son demasiado inexactas para evaluar la pureza del DNA. Esto se debe al hecho de que los valores medidos están muy cerca del límite de detección del instrumento, donde la variabilidad de la medición en comparación con los valores medidos es enorme, y los valores A280 y A230 son incluso más bajos que los de A260, y por lo tanto más cercanos al límite de detección del instrumento. Por ejemplo, el A260 de una muestra con 2 ng/µl de DNA puro sería 0,04 y, por lo tanto, su A280 teórico sería 0,02. Pero una oscilación de solo 0,01 haría que las relaciones pasaran de 4,0 (con una oscilación de -0,01 para un valor medido de 0,01) a 1,33 (con una oscilación de +0,01 para una lectura de 0,03). Por lo tanto, no es raro que las relaciones den incluso valores negativos debido a que A280 o A230 están por debajo de 0.
PUREZA DEL DNA USANDO COLORANTES FLUORESCENTES
Como los colorantes fluorescentes están disponibles para especies de ácido nucleico específicas (por ejemplo, dsDNA), la contaminación por proteínas u otras especies de ácido nucleico tiene muy poco impacto en la cuantificación de DNA usando este método. Por lo tanto, si la pureza del DNA en la muestra no es muy buena, las concentraciones de DNA notificadas por A260 pueden estar sobrevaloradas en comparación con las calculadas usando colorantes fluorescentes. Sin embargo, la cuantificación del DNA usando colorantes fluorescentes no proporciona una estimación directa de la presencia de contaminantes (lo que puede ser importante, por ejemplo, para evaluar los posibles efectos en los métodos posteriores). Si es necesario cuantificar la presencia de proteínas o RNA contaminantes (por ejemplo, para optimizar el proceso de purificación), entonces se deben tomar múltiples alícuotas de la muestra, y cada macromolécula debe cuantificarse por separado.
Integridad de los ácidos nucléicos
Para acabar, unas palabras sobre la evaluación de la integridad de los ácidos nucleicos y, en particular, del RNA. Aunque el espectro de la muestra es muy informativo sobre la pureza de los ácidos nucleicos extraídos (si el espectro difiere en gran medida del de los ácidos nucleicos puros, ello indica una pureza baja), no proporciona ninguna información sobre su integridad. Esto se debe a que el espectro de absorción de los nucleótidos libres es idéntico al de los nucleótidos que pertenecen a una molécula grande de DNA o RNA.
Para evaluar la integridad del RNA, la mejor manera es realizar una electroforesis en gel y visualizar los ácidos nucléicos utilizando un tinte intercalante fluorescente. La presencia de manchas degradadas o bandas de bajo peso molecular es indicativa de la degradación del RNA. Las intensidades relativas de los rRNA 28S y 18S pueden usarse para calcular la integridad del ARN, con una relación 2:1 que es indicativa de RNA intacto.