WAS IST LUMINESZENZ? LUMINESZENZ DEFINITION
Der Begriff Lumineszenz bezieht sich auf die Emission von Licht, das nicht durch hohe Temperaturen verursacht wird. Das Phänomen wird daher auch als "kaltes Licht" bezeichnet.
Um uns herum gibt es viele Licht emittierende Prozesse. Sie kommen entweder natürlich vor oder werden künstlich erzeugt. Beispiele für natürliche Lumineszenz sind Glühwürmchen und Phytoplankton (Biolumineszenz). Lichtemittierende Dioden (LEDs) und Computermonitore (Elektrolumineszenz) sind Beispiele für künstlich erzeugte Lumineszenz.
ARTEN VON LUMINESZENZ
In den Biowissenschaften werden verschiedene Arten von Lumineszenz verwendet. Die verschiedenen Arten von Lumineszenz können nach zwei verschiedenen Kriterien eingeteilt werden: nach der Methode der Substanzanregung und nach der Dauer der Signalemission.
A. Arten der Lumineszenz nach der Methode der Erzeugung hochenergetischer Substanzen:
Bei den meisten Arten von Lumineszenz ist eine energiereiche Substanz beteiligt, die Energie in Form von Licht abgibt. Der Mechanismus, durch den diese Substanz erzeugt wird oder die "zusätzliche" Energie erhält, um als Licht freigesetzt zu werden, ist eine nützliche Methode zur Klassifizierung von Lumineszenz.
1. Chemilumineszenz
Chemilumineszenz beschreibt die Emission von Licht als Ergebnis einer chemischen Reaktion. Die Reaktionsenthalpie liefert die erforderliche Energie, wodurch ein angeregtes Produkt oder Zwischenprodukt entsteht. Wenn das Zwischenprodukt in seinen Grundzustand fällt, sendet es ein Photon aus.
1.1 Biolumineszenz
Findet eine solche Reaktion in einem lebenden Organismus statt, z. B. in Glühwürmchen, spricht man von Biolumineszenz. An dieser biochemischen Reaktion sind ein lichtemittierendes Molekül namens Luciferin und ein Enzym namens Luciferase beteiligt. Luziferasen sind eine Familie von Photoproteinen, die in verschiedenen Insekten, Meeresorganismen und Prokaryoten vorkommen [1]. Diese Enzyme katalysieren die Oxidation des Luciferin, was zur Emission von Photonen führt. Je nach Organismus sind das Enzym und das produzierte Substrat sowie die benötigten Cofaktoren unterschiedlich. Infolgedessen variiert die Emissionswellenlänge des erzeugten Lichts, so dass die Emissionsspektren zwischen 400 nm und 620 nm liegen.
Eine der in den Biowissenschaften am häufigsten verwendeten Luciferasen ist die Firefly Luciferase, die gelb-grünes Licht bei etwa 550 - 570 nm emittiert. Ein weiteres gutes Beispiel ist die Renilla-Luciferase aus dem Seestiefmütterchen Renilla reniformis, die blaues Licht bei 480-500 nm emittiert.
2. Photolumineszenz
Photolumineszenz beschreibt die Lumineszenz einer Substanz, die durch Licht, meist ultraviolettes oder sichtbares Licht, angeregt (d. h. auf ein höheres Energieniveau gebracht) wird. Dies wird als Photoanregung bezeichnet und ist das Ergebnis der Bewegung von Elektronen auf energetisch höhere Niveaus durch die Absorption von Photonen. Als Folge der Anregung treten in der Regel verschiedene Relaxationsprozesse auf, bei denen typischerweise Photonen niedrigerer Energie wieder emittiert werden. Fluoreszenz und Phosphoreszenz sind die Hauptarten der Photolumineszenz, und ein Molekül mit fluoreszierenden Eigenschaften wird als Fluorophor bezeichnet. In den Biowissenschaften wird diese Form der Lumineszenz am häufigsten in Fluoreszenztests verwendet.
BRET und FRET beruhen auf einer besonderen Art der Energieübertragung, die als eine Form der Photolumineszenz angesehen werden kann. Bei beiden Methoden gibt es zwei Moleküle oder Gruppen, einen Donor und einen Akzeptor, wobei der Donor entweder eine Luciferase (bei BRET) oder ein Fluorophor (bei FRET) ist und der Akzeptor ein Fluorophor ist, der bei der Emissionswellenlänge des Donors angeregt werden kann. Die Anregung des Akzeptors durch den Donor erinnert an die Fluoreszenz, jedoch wird sowohl bei BRET als auch bei FRET die überschüssige Energie durch einen nicht-radiativen Prozess in Form des emittierten virtuellen Photons zum Akzeptor transportiert - diese Übertragung wird durch Dipol-Dipol-Kopplungen zwischen den Molekülen erleichtert und als Resonanz bezeichnet. Der Begriff "virtuell" weist darauf hin, dass das Photon reabsorbiert wird, bevor seine Eigenschaften, wie z. B. die Wellenlänge, eine physikalische Bedeutung erlangen [3].
3. Elektrolumineszenz
Elektrolumineszenz beschreibt die Erzeugung von Licht als Ergebnis eines elektrischen Stroms, der durch eine Substanz fließt. In den Biowissenschaften wird dies typischerweise bei einigen Formen von Immunoassays und in der Immunchemie für klinische Anwendungen verwendet.
Der elektrochemilumineszente Immunoassay (ECLIA) [2] ist eine hochempfindliche Methode, bei der aus stabilen Vorläufern (d. h. der ECL-aktiven Markierung) an der Oberfläche einer Elektrode ein elektrochemisches Zwischenprodukt erzeugt wird. Das Molekül emittiert Licht, wenn es auf ein niedrigeres Energieniveau entspannt wird.
4. Radiolumineszenz
Radiolumineszenz tritt auf, wenn bestimmte Substanzen von ionisierender Strahlung wie α-, β- oder γ-Strahlen getroffen werden. In der jüngeren Vergangenheit (1960er Jahre) wurde dieses Phänomen genutzt, um Uhrenzifferblätter im Dunkeln leuchten zu lassen.
Dieses Prinzip wird für die Trennung und den Nachweis radioaktiver Tracer durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Radio-HPLC) in verschiedenen pharmazeutischen und klinischen Anwendungen genutzt. Bei der Radio-HPLC trifft ein Elektron auf ein Szintillatormolekül und hebt es auf ein höheres Energieniveau. Der Szintillator springt sofort auf sein ursprüngliches Energieniveau zurück, indem er Photonen aussendet. Diese Photonen werden von einer Photomultiplier-Röhre (PMT) nachgewiesen.
Im Bereich der Biowissenschaften wird der Begriff "Lumineszenz" meist für Chemilumineszenz (und im weiteren Sinne für Biolumineszenz) im Gegensatz zur Fluoreszenz verwendet. Wie Sie jedoch oben gesehen haben, ist Fluoreszenz eine Unterart der Lumineszenz. Erfahren Sie mehr über die Unterschiede zwischen Lumineszenz, Fluoreszenz und Phosphoreszenz. Da dies die übliche Konvention auf dem Gebiet ist, werden wir im weiteren Verlauf des Artikels den Begriff Lumineszenz für Chemilumineszenz und Biolumineszenz verwenden, sofern nicht anders angegeben.
B. Arten von Lumineszenz nach Dauer der Signalemission
1. Flash-Lumineszenz
Assays, die ein kurzes, aber meist starkes Signal erzeugen, werden als Flash-Assays bezeichnet. Die Signalhalbwertszeit dieser Assays liegt in der Regel im Bereich von wenigen Minuten oder sogar noch kürzer. Die Herausforderung bei Flash-Assays besteht darin, dass das Signal nach der Zugabe des Testreagenzes fast sofort einen Spitzenwert erreicht und dann schnell wieder abfällt. Bei der Verwendung eines Einröhren-Luminometers ist dies kein Problem, da jede Probe sofort nach Zugabe des Startreagenzes einzeln gemessen werden kann. Aber wie sieht es stattdessen mit der Messung in einem Mikrotiterplatten-Luminometer aus?
Würde man die Reaktion in allen Vertiefungen einer 96-Well-Platte gleichzeitig starten und dann nacheinander messen, würden nur die ersten Vertiefungen mit der höchsten Signalstärke gemessen werden. In den später gemessenen Vertiefungen wäre die Intensität des Lumineszenzsignals jedoch bereits deutlich reduziert.
Die Messung von Flash-Assays in einem Mikroplatten-Lesegerät erfordert daher den Einsatz von sogenannten Injektoren. Auf diese Weise kann in jede Vertiefung zunächst das Starterreagenz zugegeben und das Signal sofort gemessen werden. Der Dual-Luciferase Reporter™-Assay und die SPARCL-Assays sind beides Beispiele für Flash-Assays.
2. Glühlumineszenz
Glow-Typ-Assays hingegen haben eine Signalintensität, die über Stunden anhält. Obwohl die Signalintensität geringer ist, wird diese Form des Lumineszenz-Assays aufgrund des viel einfacheren Arbeitsablaufs aufgrund der längeren Signalintensität, die keine Reagenzieninjektoren erfordert, oft zur Methode der Wahl. Da jedoch alle Vertiefungen gleichzeitig Licht emittieren, ist es möglich, dass Licht aus benachbarten Vertiefungen die Messung stört, ein Phänomen, das als Crosstalk bezeichnet wird (siehe unten).