Ein Gen besteht aus zwei funktionellen Hauptelementen: Zum einen aus einer sogenannten kodierenden DNA-Sequenz, die die Informationen über das produzierte Protein liefert. Zum anderen aus einer spezifische Promoter-Sequenz, die mit der kodierenden Region verknüpft ist und die Transkription des Gens reguliert. Der Promotor dient dazu je nach Bedarf die Expression des Gens zu aktivieren oder zu unterdrücken.
Der Hauptzweck des Reportergen-Assays besteht darin, den Promotor eines Gens von Interesse zu untersuchen, d.h. die Regulation seiner Expression. Dies kann durch die Verknüpfung des Promotors von Interesse mit einem leicht nachweisbaren Gen geschehen, wie beispielsweise dem Gen für die Leuchtkäfer-Luciferase, die eine Reaktion katalysiert, die Licht produziert.
Üblicherweise werden dann die Zellen verschiedene Faktoren bzw. Bedingungen ausgesetzt, oder es können Änderungen in der Reihenfolge des Reporters vorgenommen werden, deren Wirkung leicht durch Messung der Veränderungen der Lichtemission verfolgt werden kann.
Beispiele für Reportergene
Gängige Reportergene sind β-Galaktosidase, β-Glukuronidase und Luziferase. Zur Messung des exprimierten Reportergenproteins werden verschiedene Nachweisverfahren (siehe unten) eingesetzt. Dazu gehören Lumineszenz, Absorption und Fluoreszenz.
Assays, die auf Lumineszenz basieren, sind aus mehreren Gründen sehr beliebt:
- sie besitzen eine hohe Empfindlichkeit (zwischen 10 und 10.000 mal höher als die von Methoden, die auf Absorption oder Fluoreszenz basieren, je nach verwendetem spezifischen Assay und Reporter)
- die meisten Zelltypen besitzen keine endogene Luziferase-Aätivität
- Lumineszenz-Assays weisen einen großen dynamischen Messbereich auf
- sie sind schnell durchführbar
- die Kosten sind relativ niedrig
Lumineszierende Reporter-Assays werden mit einem Luminometer gemessen.
Reportergene nach Nachweismethode
| Reporter | Lumineszenz | Fluoreszenz | Absorption |
|---|---|---|---|
| Luziferase | |||
| β-Galaktosidase (β-Gal) | |||
| β-Glukuronidase (β-GUS) | |||
| Sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) | |||
| Grünes fluoreszierendes Protein (GFP) | |||
Leuchtkäfer Luziferase
Das vielseitigste und häufigste Reportergen ist die Luciferase des nordamerikanischen Leuchtkäfers Photinus pyralis. Das Protein benötigt keine posttranslationale Modifikation der Enzymaktivität. Es ist in vivo in hoher Konzentration nicht einmal toxisch und kann sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen Zellen eingesetzt werden. Die Leuchtkäfer-Luciferase katalysiert die biolumineszierende Oxidation des Luciferins in Gegenwart von ATP, Magnesium und Sauerstoff.
Dual-Luciferase® Reporter Gen-Test
Das Dual-Luciferase® Reporter (DLR) Assay System enthält zwei verschiedene Luciferase-Reporter-Enzyme, die in jeder Zelle gleichzeitig exprimiert werden. Die Firefly-Luciferase und die Renilla-Luciferase können zwischen ihren jeweiligen Biolumineszenzsubstraten unterscheiden und aktivieren sich nicht gegenseitig. Die Firefly-Luciferase wird vom interessierenden Promotor und die Renilla-Luciferase von einem Promotor gesteuert, der eine stabile Expression liefert; auf diese Weise kann die Expression der Renilla-Luciferase als interne Kontrolle verwendet werden, um Veränderungen der Zellzahl, der Transfektionseffizienz und andere Fehler auszugleichen. Dies ist zwar sehr praktisch, aber es ist darauf zu achten, dass keine der untersuchten Bedingungen die Expression der Renilla-Luciferase verändert, da dies zu falschen Schlussfolgerungen führen könnte.
Neuartige Luziferasen
In den letzten Jahren wurden weitere Luziferasen für Reportergen-Assays wie Gaussia, Cypridina oder NanoLuc® Luziferasen verwendet. Diese sogenannten "neuartigen" Luziferasen sind bis zu 1000 mal heller als Firefly- oder Renilla-Luziferasen und haben meist weitere Vorteile, wie z.B. verbesserte Stabilität, kleinere Größe, extrazelluläre Sekretion und mehr.
Application Notes zu Reportergenen
DLR Assay (Promega) with the Orion II Dual Luciferase Reporter Assay (Promega) with the Orion II Microplate Luminometer
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Monitoring of Renilla Luciferase Activities in-vitro and in-vivo The expression of a novel EnduRen™ and ViviRen™ Renilla luciferase reporter gene (Promega) in vitro and in vivo is explored
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Bioluminescence Imaging using NightOWL Bioluminescence Imaging using NightOWL LB 981 NC 100. Cells expressing luciferase gene under the control of a constitutive promoter were used as a model of in vivo proliferation of cancer cells.
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Luciferin bioavailability in mice during in-vivo imaging To determine the optimal luciferase activity detection time, time course experiments were performed.
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Circadian Clock with NightSHADE Getting to Know The Circadian Clock and Plant Growth With NightSHADE
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Analysis of circadian rhythms using NightShade Improved experimental setup for analysis of circadian rhythms using the NightShade Plant In Vivo Imaging System
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DLR™ VALIDATION OF THE TRISTAR 3 Validation of the Tristar 3 with the Dual-Luciferase® Reporter System from Promega.
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DLR™ VALIDATION OF THE TRISTAR 5 Validation of the Tristar 5 for the Dual-Luciferase® Reporter System from Promega.
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DLR™ VALIDATION OF THE CENTRO LB 963 Validation of the Centro LB 963 for the Dual-Luciferase® Reporter System from Promega.
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Für Reportergen-Assays empfohlene Instrumente
Dual-Luciferase und NanoLuc sind eingetragene Marken der Promega Corp.