Klassifizierung von in vivo Methoden zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen

Es gibt viele Möglichkeiten der Klassifizierung von in vivo-Methoden, die zur Untersuchung von PPI verwendet werden. Steht insbesondere die Erkennung und Quantifizierung der Interaktion im Vordergrund, so kann man sie anhand der Eigenschaften des Reportersystems klassifizieren, das von den jeweiligen Methoden verwendet wird. 

Alle hier vorgestellten Methoden basieren auf einem Reporter-System das aus zwei Teilen besteht: Der eine Teil ist mit dem einen der interessierenden Proteine (manchmal als "Köder"-Protein bezeichnet) und der andere mit dem anderen interessierenden Protein (manchmal als "Beute"-Protein bezeichnet) verbunden.  Wenn beide Proteine miteinander interagieren, werden die beiden Teile des Reporter-Systems in räumliche Nähe gebracht und haben eine eindeutig nachweisbare Wirkung. Die Begriffe "Köder" und "Beute" werden normalerweise verwendet, wenn es ein Protein von Interesse gibt und das Ziel darin besteht, nach interagierenden Partnern zu "jagen". In vielen Fällen sind jedoch beide Partner bereits bekannt und das Ziel ist es, die Interaktion genauer zu untersuchen (z.B. ihre Regulation).

Die nachfolgend genannten Methoden werden in Xing et al. 2016 näher erläutert.

Methoden nach der Funktionalität des Reporter-Systems

Ein wichtiger Unterschied ist, ob die beiden Teile des Reporter-Systems von selbst voll funktionsfähig sind oder nicht.

 

Proteinfragment Komplementatierungs-Assays (Protein fragment Complementation Assays, PCA)

Bei dem Proteinfragment-Complementation Assays (PCA) ist der Reporter ein einzelnes Protein, das in zwei Fragmente gespalten wurde. Die Fragmente allein sind nicht funktionsfähig, aber das Protein kann sich wiederherstellen, wenn beide Fragmente in relative Nähe zueinander gebracht werden, und seine Funktionalität wiederherstellen. So wird beispielsweise beim Split-Luciferase-Komplementierungstests das Luciferase-Molekül in zwei Fragmente gespalten, von denen keines Licht produzieren kann, aber wenn beide Fragmente nahe genug sind, rekonstituiert sich die Luciferase und kann wieder Licht erzeugen. Beispiele für PCA-Methoden sind das Split-Ubiquitinsystem und der Split-Luciferase-Komplementationsassay.

Zwei-Hybrid-Assays

Beim Zwei-Hybrid-Assays ist jeder Teil des Reporter-Systems ein Protein oder eine Proteindomäne, die voll funktionsfähig ist, aber ein spezifischer, messbarer Effekt wird nur erzeugt, wenn beide Teile nahe genug sind. So sind beispielsweise bei Hefe-Zwei-Hybrid-Assays sowohl die DNA-Bindungsdomäne, die mit einem der interessierenden Proteine verknüpft ist, als auch die Transaktivierungsdomäne, die mit dem anderen Protein verknüpft ist, unabhängig voneinander stabil und funktional, aber nur wenn sie sich in unmittelbarer Nähe zueinander befinden, wird das Reportergen exprimiert. Ähnlich sind beide fluoreszierenden Proteine, die in einem FRET-Assay verwendet werden, fluoreszierend, aber das Akzeptor-Protein emittiert Licht nur dann, wenn es eine Wechselwirkung zwischen den Proteinen von Interesse gibt.

Methoden nach dem detektierten Signal

Eine weitere wichtige Klassifizierung ist die Art des Signals, das durch den Reporter erzeugt wird und das zur Erkennung der Interaktion verwendet wird. Dies hat Auswirkungen auf die Instrumentierung, die zur Detektion benötigt wird, sowie auf die Möglichkeiten, die es für eine genaue Quantifizierung bietet, und die Eignung für Hochdurchsatzanalysen und dergleichen.

Methoden zur Untersuchung der Genexpression

Wenn beide interessierenden Proteine interagieren, bewirkt bei dieser Art von Verfahren die Kombination der DNA-Bindungsdomäne und der Transaktivierungsdomäne die Expression des Reporters. Bei den Reportern gibt es in der Regel zwei mögliche Formen: prototrophe Marker wie HIS3 oder ADE2, die das Überleben auf einem erschöpften Wachstumsmedium ermöglichen, oder chromogene Enzyme wie ß-Galaktosidase, die für die Selektion durch Blau-Weiß-Färbung der Kolonien verwendet werden können. Sowohl der Hefe-Zwei-Hybrid-Assay als auch das Split-Ubiquitin-System (siehe unten) basieren auf der Genexpression.

Diese Art von Reportern ist nicht geeignet, dynamischen Veränderungen in der Interaktion zu folgen, und kann nur durch Absorption und bei Verwendung eines chromogenen Enzyms quantifiziert werden. Solche Reporter können jedoch verwendet werden, um eine große Anzahl von binären Interaktionen zu bewerten, indem zwei haploide Paarungstypen miteinander vermischt werden, die mit verschiedenen Arten von Proteinen von Interesse transformiert wurden. Daher sind sie sehr nützlich für das groß angelegte Screening von Protein-Protein-Interaktionen.

In der klassischen Version dieser Methode ist die N-terminale DNA-Bindungsdomäne des Transkriptionsaktivators GAL4 an das eine interessierende Protein und die C-terminale Transaktivierungsdomäne an das andere gebunden. Wenn beide Proteine interagieren, erzeugt ihre Assoziation einen chimären Transkriptionsfaktor, der die Genexpression stromabwärts der stromaufwärts gelegenen Aktivierungssequenz GAL1 aktiviert (Fields and Song 1989). Weitere Split-Sonden wurden erfolgreich etabliert. Der Hefe-Zwei-Hybrid-Assay ist einfach durchzuführen, kann aber nur zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen mit nuklearer Lokalisation verwendet werden.

Dieses System ist im Konzept dem Hefe-Zwei-Hybrid-System ähnlich und ebenso einfach durchzuführen. Es hat aber den zusätzlichen Vorteil, dass es auf praktisch jedes Protein anwendbar ist, nicht nur auf nukleare. Wie oben erläutert, ist das Split-Ubiquitin System eine Art PCA: Hierbei wird das Protein Ubiquitin in zwei nicht-funktionale Fragmente gespalten, die jeweils mit jedem Mitglied des interessierenden Proteinpaares fusioniert sind. Wenn beide Fragmente interagieren, baut sich Ubiquitin wieder zusammen und wird funktionsfähig. Dadurch wird die Spaltung über die Ubiquitinspezifische Protease gefördert. In der klassischen Version führt diese Spaltung zur Freisetzung eines Transkriptionsfaktors, der dann die Expression des Reportergens aktiviert.