Direkter ELISA

Der direkte ELISA wird typischerweise zur Analyse einer Immunantwort auf ein Antigen verwendet, z.B. zur immunhistochemischen Färbung von Zellen oder Geweben. Diese ELISA-Methode erfordert ein Antigen, das auf eine Multiwellplatte aufgetragen wird. Für den Nachweis wird ein Antikörper verwendet, der direkt mit einem Enzym konjugiert wurde. Der Arbeitsablauf dieser Methode ist relativ einfach und erfordert nur wenige Schritte.

Vor- und Nachteile des direkten ELISAs

Vorteile des direkten ELISAs

  • Einfach und schnell – es wird nur ein einziger Antikörper benötigt und der Workflow besteht aus wenigen Schritten.
  • Weniger fehleranfällig - relativ geringe Anzahl von Pipettierschritten im Vergleich zu anderen ELISA-Methoden und da nurein Antikörper erforderlich ist, kein Risiko einer Kreuzreaktivität des Antikörpers.

Nachteile des direkten ELISAs

  • Eingeschränkte Empfindlichkeit - kein Signalverstärkungsschritt
  • Zeitaufwändige Assayentwicklung - jedes Assayziel benötigt einen spezifischen konjugierten primären Antikörper, was den Assay auch relativ teuer macht.
  • Risiko einer begrenzten Antikörperreaktivität - die Bindung des Enzyms an den Antikörper kann die räumliche Verfügbarkeit von Stellen auf dem Antikörper einschränken, die an das Antigen binden sollen.

Indirekter ELISA

Der indirekte ELISA - die beliebteste ELISA-Methode - verwendet ein 2-stufiges Detektionsverfahren. Zunächst bindet ein nicht markierter primärer Antikörper spezifisch an das Antigen. Dann bindet ein enzymkonjugierter sekundärer Antikörper spezifisch an den primären Antikörper. Diese Methode wird typischerweise verwendet, um die Gesamtantikörperkonzentration in Proben zu bestimmen.

Vor- und Nachteile des indirekten ELISAs

Vorteile des indirekten ELISAs

  • Flexibilität - der sekundäre Antikörper kann verwendet werden, solange er mit der Wirtsart des primären Antikörpers übereinstimmt und es gibt eine große Auswahl an markierten sekundären Antikörpern, die im Handel erhältlich sind
  • Sensitivität - mehr als ein markierter Antikörper kann den primären Antikörper binden, da jeder primäre Antikörper mehrere Epitope enthält.
  • Maximale Immunreaktivität - keine Markierung stört die Stellen auf dem primären Antikörper.
  • Wirtschaftlich - es werden weniger markierte Antikörper benötigt.

Nachteile des indirekten ELISAs

  • Komplexerer Workflow - zusätzlicher Inkubationsschritt für den sekundären Antikörper erforderlich
  • Potenzielle Kreuzreaktivität - unspezifisches Signal durch Kreuzreaktivität mit dem sekundären Antikörper

Sandwich ELISA

Im Sandwich-ELISA wird ein sogenannter Capture-Antikörper zur Beschichtung der Wells verwendet, der dann das Antigen aus der Probe bindet. Anschließend wird das Antigen entweder in direkter oder indirekter ELISA-Konfiguration nachgewiesen. Diese Methode wird häufig zur Analyse komplexer Proben eingesetzt.

Vor- und Nachteile des Sandwich-ELISAs

Vorteile des Sandwich-ELISAs

  • Flexibilität und Sensibilität - sowohl direkte als auch indirekte Nachweisverfahren können eingesetzt werden.
  • Hohe Spezifität - zwei Antikörper werden zum Nachweis des Antigens verwendet.
  • Geeignet für komplexe Proben - eine Aufreinigung des Antigens vor der Messung ist nicht erforderlich.

Nachteile des Sandwich-ELISAs

  • Komplexer Workflow - erfordert mehr Inkubationsschritte als andere ELISA-Formate.
  • Erfordert weitere Optimierungen - die Kreuzreaktivität zwischen den verschiedenen verwendeten Antikörpern muss überprüft werden.

Kompetitiver ELISA

Jeder der oben genannten Assay-Typen kann an einen kompetitiven ELISA, auch bekannt als inhibitorischer ELISA, angepasst werden. Diese Methode basiert darauf, dass das Probenantigen mit einem Inhibitorantigen konkurriert und an eine begrenzte Menge markierter Antikörper bindet. Die Mikroplatte wird mit dem Inhibitor-Antigen vorbeschichtet. Anschließend wird die mit markiertem Antikörper vorinkubierte Probe in die Wells gegeben. Das erkannte Signal wird umso schwächer, je mehr Antigen in der Probe war, da weniger Antikörper in der Lage sind, an das Antigen in den Wells zu binden. Diese Methode wird typischerweise zur Analyse kleiner Antigene verwendet, die nur ein einziges Epitop besitzen.

Vor- und Nachteile des kompetitiven ELISAs

Vorteile des kompetitiven ELISAs

  • Höchste Flexibilität - kann auf direktem, indirektem oder Sandwich-ELISA-Format basieren.
  • Höchste Spezifität - das Antigen wird spezifisch erfasst und nachgewiesen.
  • Sehr robust - minimiert die Auswirkungen von Probenverdünnung und Probenmatrixeffekten.

Nachteile des kompetitiven ELISAs

Eher zeitaufwendig - sehr komplexes Protokoll

Es gelten die Nachteile des gewählten Erkennungsformats.