DNA-Reinheit in der UV-Spektrophotometrie

Wie wir bei der Diskussion über DNA-Quantifizierungsverfahren beschrieben haben, ist die Messung der Absorption einer Probe bei 260 nm eine weit verbreitete Methode zur Quantifizierung der DNA-Konzentration. Andere Makromoleküle absorbieren jedoch bei 260 nm: vor allem Proteine und RNA, aber auch Substanzen, die bei der Reinigung verwendet werden. Die Verunreinigung der Probe durch Substanzen, die bei 260 nm absorbieren, führt zu einer Überschätzung der DNA-Menge und damit gegebenenfalls zu einer geringeren DNA-Zugabe als für ein nachfolgende Downstream-Verfahren erforderlich. Viele dieser Verunreinigungen können durch Messung der Absorption der Probe bei anderen Wellenlängen als 260 nm geschätzt werden.

A340

Eine hohe Absorption bei etwa 340 nm (oder 320 nm) ist ein Indikator für Partikel in Suspension. Da sie normalerweise keine nachgeschalteten Verfahren beeinflussen, wird A340 in der Regel nur von der Absorptionsmessung subtrahiert, um den Einfluss von Partikeln auf die Quantifizierung zu korrigieren. Diese Subtraktion wird manchmal als Spektrumsnormalisierung bezeichnet.    

Verhältnis A260/A280

Proteine haben eine höhere Absorption bei 280 nm als bei 260 nm. Das Verhältnis zwischen den Absorptionen bei 260 (A260) und 280 nm (A280) wird allgemein als Mittel zur Beurteilung der Kontamination durch Proteine in einer Probe gereinigter DNA akzeptiert. Das A260/A280-Verhältnis einer Probe, die reine DNA ohne Proteinverunreinigung enthält, sollte zwischen 1,8 und 2,0 liegen, wobei Werte unter 1,8 eine Kontamination durch Protein und Verhältnisse über 2,0 eine Kontamination durch RNA anzeigen. Ein niedriges A260/A280-Verhältnis könnte auch auf das Vorhandensein von Phenol hinweisen, einem Additiv, das in einigen DNA-Aufreinigungsmethoden verwendet wird.

Die Empfindlichkeit des A260/A280-Verhältnisses zum Nachweis einer Proteinverunreinigung ist sehr gering: Ein Verhältnis von 1,75 - also nur 0,05 unter 1,80 - könnte bereits auf einen Protein-Anteil von etwa 50 % in der Probe hinweisen. In diesem Beispiel wäre unsere DNA-Konzentration tatsächlich nur die Hälfte der von A260 berechneten Konzentration. Obwohl einige Systeme eine korrigierte DNA-Konzentration basierend auf der Abweichung des Spektrums der Probe vom theoretischen Spektrum der reinen DNA anbieten, machen die hohen Proteinmengen, die für die Messbarkeit der Differenz erforderlich sind, diese Korrektur unzuverlässig.

Verhältnis A260/A230

Proteine sind nicht die einzige mögliche Verunreinigung in gereinigten DNA-Proben. Einige gängige Verunreinigungen verursachen eine relative Erhöhung der Absorption bei 230 nm im Vergleich zu 260 nm, und das Verhältnis A260/A230 wird daher ebenfalls zur Beurteilung der DNA-Reinheit verwendet. Das Verhältnis A260/A230 der reinen DNA beträgt 1,8. Ein niedrigeres Verhältnis zeigt eine Kontamination durch Phenol, EDTA, Guanidinthiocyanat, Triton X-100 oder Kohlenhydrate an. Auch Proteinverunreinigungen erhöhen dieses Verhältnis, aber das Verhältnis A260/A280 wird normalerweise als Indikator für eine Proteinverunreinigung bevorzugt, da es nicht von einem so breiten Spektrum möglicher Verunreinigungen beeinflusst wird.

Grenzen der UV-Spektrophotometrie zur Beurteilung der DNA-Reinheit

Die Nachweisgrenze der UV-Spektrophotometrie liegt typischerweise bei 2 ng/µL DNA. Das bedeutet, dass es nicht möglich ist, die Reinheit von DNA-Proben unterhalb dieser Konzentration mit Hilfe dieser Methode zu beurteilen. Selbst bei Konzentrationen nahe der Nachweisgrenze sind sowohl die Verhältnisse A260/A280 als auch A260/A230 zu ungenau, um die Reinheit der DNA zu beurteilen Dies wird dadurch verursacht, dass die Messwerte sehr nahe an der Nachweisgrenze des Geräts liegen, wobei die Variabilität der Messung im Vergleich zu den Messwerten enorm wird und die Werte A280 und A230 noch niedriger sind als die von A260 und somit näher an der Nachweisgrenze des Geräts liegen. So wäre beispielsweise das A260 einer Probe mit 2 ng/µL reiner DNA 0,04, und somit wäre ihr theoretischer A280 0,02. Aber eine Oszillation von nur 0,01 würde Verhältnisse von 4,0 (mit einer Oszillation von -0,01 für einen Messwert von 0,01) bis 1,33 (mit einer Oszillation von +0,01 für einen Messwert von 0,03) ergeben. Daher ist es ist nicht ungewöhnlich, dass Verhältnisse sogar negative Werte ergeben, weil A280 oder A230 unter 0 gehen.

DNA-Reinheit mithilfe von Fluoreszenzfarbstoffen

Da Fluoreszenzfarbstoffe für bestimmte Nukleinsäure-Spezies (z.B. dsDNA) verfügbar sind, hat die Kontamination durch Proteine oder andere Nukleinsäure-Spezies nur sehr geringe Auswirkungen auf die Quantifizierung der DNA unter Verwendung dieser Methode. Aus diesem Grund können, wenn die DNA-Reinheit in der Probe nicht sehr gut ist, die von A260 erfassten DNA-Konzentrationen höher sein als die von Fluoreszenzfarbstoffen. Die DNA-Quantifizierung mit Fluoreszenzfarbstoffen gibt jedoch keine direkte Schätzung des Vorhandenseins von Verunreinigungen wieder (was beispielsweise wichtig sein könnte, um die möglichen Auswirkungen auf nachgelagerte Methoden zu bewerten). Wenn das Vorhandensein von kontaminierenden Proteinen oder RNAs quantifiziert werden muss (z.B. um den Reinigungsprozess zu optimieren), müssen mehrere Aliquots der Probe entnommen werden, und jedes Makromolekül muss separat quantifiziert werden.

Nukleinsäureintegrität

Abschließend noch ein paar Worte zur Bewertung der Integrität der DNA und vor allem der RNA. Das Spektrum der Probe ist zwar sehr aufschlussreich über die Reinheit der extrahierten Nukleinsäuren (so dass erfahrene Anwender leicht erkennen können, ob sich das Spektrum sehr stark von dem der reinen Nukleinsäuren unterscheidet und somit auf eine geringe Reinheit hinweist), gibt aber keinerlei Auskunft über ihre Integrität. Dies liegt daran, dass das Absorptionsspektrum der freien Nukleotide identisch ist mit dem der Nukleotide, die zu einem großen DNA- oder RNA-Molekül gehören.

Um die Integrität der RNA zu beurteilen, ist noch immer eine Gelelektrophorese die Methode der Wahl, wobei die DNA mit einem interkalierenden Farbstoff visualisiert wird. Das Vorhandensein von Schlieren mit geringerem Molekulargewicht ist ein Hinweis auf den Abbau von RNAs. Die relativen Intensitäten der 28S- und 18S-RRNAs mit einem Verhältnis von 2:1 sind indikativ für intakte RNAs.